国内主要鸭养殖区传染性浆膜炎流行血清学调查实验报告

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(1.山东省蓬莱市大辛店畜牧兽医工作站， 山东 烟台 265612；

0 引言

鸭传染性浆膜炎又叫鸭疫里默氏杆菌病，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鸭的一种接触性、急性或慢性、败血性的传染病，主要侵害2～7周龄的小鸭[1]。该病的特征为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎、关节炎及麻痹，是造成小鸭死亡最严重的细菌性传染病之一，广泛分布于世界上各养鸭国家[2]。疫苗免疫接种是控制该疾病非常有效的措施，但RA血清型较多(到目前为止，共报道有21个血清型)，各血清型之间没有交叉保护，这要求使用疫苗的抗原血清型必须和生产中流行菌株的血清型相一致[3]。因此，对RA在鸭群中的流行情况进行分离鉴定将有助于该疫苗的研制生产，以达到控制疾病的要求。

1 实验目的

通过分离细菌，鉴定分离细菌的血清类型，从而了解我国目前鸭养殖区鸭传染性浆膜炎的主要流行血清型类型，以用于指导疫苗的研制。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 标准血清及培养基

抗1-21型RA 标准血清由成都天邦生物制品有限公司提供。普通营养琼脂、半固体琼脂、麦康凯琼脂、巧克力琼脂、5% 绵羊鲜血琼脂、P-L肉汤及P-L琼脂由实验室制备。

2.1.2 临床样品

来自全国主要鸭养殖区的患有典型鸭传染性浆膜炎的临床样品用于鸭里默氏杆菌的细菌分离鉴定。

2.1.3 实验动物

实验昆明种小白鼠，体重20 g，购置华西医科大学实验动物中心；健康雏鸭，购置某种鸭场生产的4日龄雏鸭，购买后隔离饲养3 d，经鉴定健康后于7日龄用于细菌致病性实验和免疫实验；鸭胚由非免疫鸭蛋孵化而来。

2.2 实验方法

2.2.1 细菌分离

无菌取病死鸭的脑、心血、肝脏、脾等病料，接种于麦康凯琼脂、巧克力琼脂等，37 ℃厌氧培养24 h，再挑取单个菌落作进一步纯培养。无菌取相同病料常规处理后接种于10 日龄鸭胚绒毛尿囊腔(0.2 mL/胚)。观察鸭胚能否产生病变或死亡，若鸭胚不死亡，则盲传3代。

2.2.2 标准及待检菌株抗原的制备

将RA 接种至P—L琼脂平板，培养24 h后，用FPSS(含0.3%甲醛的生理盐水)洗下菌落并离心，用FPSS洗涤，离心2次，最后将菌体以FPPS悬浮，调节至D525nm值为0.2作为制备抗血清的抗原和用作试管凝集的抗原[4]。细菌经P-L琼脂平板培养24 h，每平板纯培养物用l0 mL溶液(0.3%甲醛、8.5%NaCL、0.02 moL/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0)洗下制成菌悬液，于沸水中煮1 h，冷却后，4 000 r/min离心30 min，上清液作为琼扩抗原。

2.2.3 抗标准及其抗待检菌株抗体的制备

将2.2.2制备的抗原与等量的弗氏完全佐剂研磨成乳剂，于第l、8、15、23 d免疫体重为3 kg的健康鸡，每只鸡皮下注射0.5mL(分5点注射，每个注射点0.1 mL)，第30天每只鸡静脉注射0.5 mL不含佐剂的菌体抗原，第45天采血检测抗体效价，琼扩效价≥1：32为合格。

2.2.4 分离菌的鉴定

2.2.4.1 形态特征

将各株细菌24 h肉汤静置纯培养菌涂片，革兰氏染色，油镜观察；将液体培养菌离心，收集菌体，再用生理盐水洗3次后，用适量生理盐水悬浮，先在铜网上吸附5 min，再用2 磷钨酸(pH 6.8)负染3 min，吸干水分，用H-6O透射电镜观察。

2.2.4.2 PCR 检测

应用PCR方法快速检测鸭里默氏杆菌，检测引物如下。

P1: 5 ’ - GAACTTTGGTCTTGGTATCC - 3 ’

P2: 5 ’ - CAGATGCAGCTCTTTCTCTA - 3 ’

扩增片段长度为671bp。PCR产物经EcoR I酶切进行进一步鉴定，酶切反应在20 μL体系中进行，包括：10ul PCR 纯化产物，2 μL EcoR I,2 μL EcoR I buffer ，加水至20 μL，37 ℃作用6 h。PCR产物和酶切产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.2.5 血清学鉴定

玻片凝集试验：于净载玻片滴蒸馏水1滴，用接种环沾取待检菌的纯培养物少许，于蒸馏水中混匀，滴加未稀释的阳性血清1滴。将载玻片轻轻反复摆动，或用接种环涂开，同时观察结果，几秒钟后，出现清晰的乳白色絮状凝集块者，即为阳性反应。

琼脂扩散沉淀试验：NaCL和琼脂糖的最终浓度分别为8.5%和0.9%，打梅花孔，血清加在中央孔，抗原加在外围6个孔。置37℃湿盒中过夜后，判读结果。

2.2.6 不同血清型菌株的致病性试验

雏鸭接种试验：用灭菌生理盐水洗下24 h固体培养基上的菌落，调整菌数为3.0×109CFU/mL。颈部皮下注射，0.4 mL/只。每个血清型选择1株细菌接种7日龄鸭10只，隔离饲养。同时设相应株细菌相同菌数煮沸5 min接种7日龄鸭10只作对照。出现病死鸭，作细菌分离试验，以确定其死因。

小鼠接种试验：3只昆明小鼠腹腔接种步骤(1)相应株细菌各0.5mL，3只小鼠不接种作为对照，均隔离饲养。

3 结果

3.1 形态特征

不同血清型鸭疫里默氏杆菌的形态特征相同，均为革兰氏阴性的小杆菌，无芽胞，不能运动，有荚膜。纯培养菌涂片，美蓝染色，可见菌体多为杆状，常单个存在，少数成双排列，偶见个别菌体呈长丝状排列；经瑞氏染色的标本，可见部分菌体两端浓染。透射电镜观察显示，菌体无菌毛或鞭毛。

3.2 PCR鉴定

各个检测菌株经PCR扩增后，经1%的琼脂糖电泳出现了预期的目的条带(671bp)，对PCR产物经EcoR I 酶进行酶切，经1%的琼脂糖电泳出现了预期的的494bp和177bp两条酶切条带，说明待检菌株均含有鸭里默氏杆菌菌株。

3.3 分离菌的致病性

各血清型受试菌株普遍具有较强的致病性，雏鸭接种后48 h，部分鸭开始出现症状。剖检可观察到心包炎、肝周炎和气囊炎、脾肿大等典型病变。

3.4 血清型分布

从不同地方分离到的鸭里默氏杆菌的血清型分布见表1。从表1可以看出，我国目前鸭里默氏杆菌的血清型有1～8型、10、11型、13型、14型，15型，其中1型所占比例最大，是我国最主要的血清流行型。

表1 我国鸭里默氏杆菌不同血清型分布

4 结语

本实验项目从全国各地送检的样品中一共分离到1 151株鸭里默氏杆菌，从血清型实验结果可以知道，目前我国鸭的主要养殖区内鸭里默氏杆菌的血清型为1型，占本次分离菌株的36.5%(420株/1151株)，为该病原的优势流行血清型。

[1] 冯秀红, 冯开容, 曹建伟,等. 1例鸭疫里默氏杆菌病的诊治[J]. 养禽与禽病防治, 2013(2):19-20.

[2] 孙乐天. 鸭传染性浆膜炎的症状、诊断及防制措施[J]. 饲料博览, 2017(5):57.

[3] 周小进. 鸭疫里默氏杆菌特异性单克隆抗体的研制以及生物被膜和OmpA缺失株的研究[D].江苏:扬州大学, 2010.

[4] 何辉. 华南地区鸭疫里默氏杆菌流行病学调查及四价灭活疫苗的研制[D].广东:华南农业大学, 2006.

向华莉，女，高级畜牧师，从事种鸭饲养繁育工作。