自噬在胰腺癌发生及治疗中的作用研究进展

侍书成，杨波

（苏州大学第三附属医院肝胆外科，江苏常州213003）

自噬是真核细胞降解细胞内大分子物质和受损细胞器的过程，具有广泛的生物学作用。作为细胞内的一种自我防御机制，自噬可通过调节能量代谢和蛋白质或细胞质量控制等方式稳定细胞内环境和维持细胞正常功能。自噬的异常与感染、免疫、衰老、肿瘤、神经变性疾病等多种疾病的发生发展有关，其中，自噬与肿瘤的关系备受关注。自噬在肿瘤的发生、发展过程中发挥双向调节作用，既可对肿瘤细胞产生抑制作用，又可促进其发生和发展。本文就自噬及其与胰腺癌之间关系的研究进展进行综述。

1　自噬的分类与过程

自从1963年Deter和De Duve［1］首次提出自噬这一概念以来，自噬的发生机制已得到大量研究阐明。按照发生过程的不同，自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。巨自噬是最常见也是最主要的自噬形式。通常认为内质网是自噬体膜的重要来源，电子断层扫描已证实内质网与自噬体之间存在关联［2］。也有研究认为线粒体、细胞膜、核膜、高尔基体等是自噬体膜的来源。但是由于这些结构形成自噬体过程中缺乏特异性的蛋白标志物，使得自噬体膜的来源问题仍未明确［3］。

自噬起始阶段，在起始信号如饥饿、缺氧刺激下，调控自噬的中心分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性受到抑制，mTOR对 Unc-51样激酶（Unc-51-like kinase 1，ULK1）的磷酸化作用减弱，使ULK1激活并进一步活化 ULK 1复合体——ULK 1／2-Atg13-FIP200-Atg101。随后ULK1复合体从细胞质定位到内质网特定部位进而募集VPS 34复合体，VPS 34通过磷酸化磷脂酰肌醇产生1，2-棕榈酰磷脂酰肌醇-3-磷酸（phosphatidylinositol-3-phosphate，PI3P）。PI3P是构成自噬体膜的基础，可组装一些含有FYVE和PX结构域的蛋白或自噬相关蛋白Atg至自噬体形成部位，启动自噬体的形成过程。自噬过程中，VPS 34结合VPS 15而被激活并组成VPS 34复合体的核心，此时Beclin1从Beclin1／Bcl2复合体中的非激活状态解离为激活状态，参与组成VPS 34复合体。Beclin1可进一步募集Atg 14和抗紫外线辐射相关基 因 （UV irradiation resistance-associated gene，UVRAG）蛋白至 VPS 34复合体［4］，促进自噬体的形成、成熟和运输。而 VMP 1，Ambra-1，Bif-1，Rubicon等也可参与构成VPS 34复合体，对自噬体的形成起正性或负性调节作用。此外，当细胞处于低ATP状态时，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）也可感受胞内AMP水平，通过磷酸化激活 TSC1／TSC2（tuberous sclerosis complex proteins）复合体来抑制mTOR或直接磷酸化ULK 1促进自噬［5］。

在自噬体延长阶段，微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）起到了关键作用。细胞中LC3前体经Atg4切割显露出C末端甘氨酸残基形成LC3-Ⅰ，随后LC3-Ⅰ再经Atg7和Atg3活化，在Atg5-Atg12-Atg16L1组成的Atg16复合体作用下形成具有膜结合力的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ是自噬中特异性最强的标志物，在Atg16复合体与LC3-Ⅱ的协助下，自噬体膜泡延长、包裹待降解内容物直至形成闭合的含双层膜结构的成熟膜泡。最后自噬体运输至溶酶体，在溶酶体中水解酶的作用下降解包裹的内容物。

2　胰腺癌中自噬的上调及其意义

Réz等［6］在 1999年首次报道胰腺癌中的自噬现象。他们在药物诱导的胰腺癌动物模型中发现，在正常腺泡上皮向非典型腺泡上皮转变过程中自噬活动也逐渐增加。随后的一个对71例胰腺癌患者的回顾性研究中，免疫组化检测结果显示自噬相关蛋白LC3在未接受化疗的胰腺癌患者癌组织周边显著增加，且LC3表达增加与患者的不良预后密切相关［7］。胰腺癌中LC3的上调标志着自噬激活，且自噬是细胞内一个不断变化的动态过程。LC3的上调可以理解成自噬流的活化，也可能是自噬的后半进程（如自噬溶酶体降解）受阻的表现，所以单从LC3水平推测自噬活性并不能明确两者间功能相关性。Yang等［8］采用GFP-LC3标记法和免疫组化染色法，发现胰腺癌细胞系中LC3-Ⅱ和自噬相关蛋白Atg7的表达明显高于正常胰腺导管细胞。进一步用电子显微镜也观察到胰腺癌细胞中自噬体与溶酶体的融合过程。与单纯检测个别自噬相关标志相比，通过多种标志物及检测方法来检测自噬水平，能更准确反映细胞内自噬的动态激活。他们还发现胰腺癌转移的淋巴结和浸润的神经纤维中也存在高强度LC3染色。以上研究提示异常的自噬参与胰腺癌的发生发展过程，甚至肿瘤的转移，并可能影响胰腺癌的预后。

3　单纯抑制自噬与胰腺癌的关系

Kim等［9］研究发现，营养缺乏状态可通过抑制mTOR诱导胰腺癌PANC-1细胞自噬水平的升高，当用自噬抑制剂氯喹（抑制自噬溶酶体的降解）或渥曼青霉素（抑制自噬体的形成）抑制自噬后，胰腺癌细胞的存活率降低。同时，免疫组化染色发现经氯喹与渥曼青霉素处理后，肿瘤细胞中caspase-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶显著升高，且caspase抑制剂Z-VAD可部分抑制氯喹与渥曼青霉素引起的细胞死亡。这些证据表明，自噬可作为一种细胞保护反应，通过抗凋亡机制促进胰腺癌细胞存活。氯喹与渥曼青霉素可通过抑制自噬促进肿瘤细胞凋亡。其他研究也表明抑制自噬可以促进细胞凋亡，如特异性的神经元敲除Atg5或Atg7，可引起小鼠神经元退化和凋亡［10］。

Yang等［8］研究发现氯喹或Atg5 siRNA阻断自噬后，胰腺癌细胞内氧消耗和氧化磷酸化水平降低，细胞增殖受到抑制，与之伴随发生的是细胞内ROS水平的升高以及DNA双链断裂片段增多。而ROS抑制剂（抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸）可明显降低胰腺癌细胞内的自噬水平和部分减轻因自噬抑制造成的肿瘤细胞的增殖抑制。这提示自噬可通过抑制胰腺癌细胞内ROS的生成，维持细胞内DNA的稳定，从而起到对肿瘤的保护作用。同时他们还发现自噬可提供三羧酸循环所需的中间代谢物，从而维持细胞内能量代谢平衡。

自噬可通过抑制凋亡、减少ROS生成来维持基因组稳定和能量代谢平衡以促进胰腺癌的发生发展。因此，通过抑制自噬来影响肿瘤生物学行为的研究也逐渐成为抗胰腺癌治疗的热点。其中关于自噬抑制剂氯喹及其类似物羟氯喹的研究较为突出。但Wolpin等［11］的研究显示，羟氯喹单药治疗胰腺癌并不能达到普遍的自噬抑制效果，因此认为单独抑制自噬或许不足以抑制人体胰腺癌的生长。

此外，自噬在肿瘤中扮演的角色，不仅取决于肿瘤的类型和发展阶段，还取决于肿瘤的基因谱。胰腺癌的发展往往伴随基因突变，其中Kras突变出现在几乎100%的胰腺癌中，约75%的胰腺癌伴有p53缺失或突变［12－13］。Rosenfeldt等［12］对基因工程小鼠模型的研究发现，小鼠胰腺Kras突变（G12D位点突变，KrasG12D／＋）诱导了自发性癌前损害——Pan-INs。随着时间的推移，PanIN经历PanIN-2、PanIN-3逐步发展至胰腺癌。然而当敲除自噬相关基因Atg 7或Atg 5时，小鼠只发生PanIN-1和少量的PanIN-2，而形成PanIN-3和胰腺癌的过程却受到阻碍。这表明Kras突变（p53正常）诱导发生的胰腺癌需要自噬的参与。然而构建 KrasG12D／＋、p53－／－小鼠模型发现，敲除Atg 7组的小鼠死亡时间明显快于未敲除组，而且Atg7的缺失加快了肿瘤形成。因此，胰腺癌的发展过程中，自噬所起的作用受到p53基因的调节：当胰腺癌中p53未发生缺失或突变时，自噬促进肿瘤发展，而当p53发生缺失或突变，自噬抑制肿瘤的发展。与Yang等［8］的研究结果不同，Rosenfeldt等［12］采用羟氯喹处理Ras诱导的p53缺失胰腺癌小鼠时，羟氯喹不但未显示肿瘤抑制作用，反而加快了肿瘤的生长并明显缩短了小鼠生存期。所以，应用羟氯喹时应重视肿瘤基因突变谱，尤其伴有p53突变的肿瘤，其抗肿瘤效应尚待进一步研究。虽然Rosenfeldt等［12］对氯喹或羟氯喹应用于临床的安全性提出了质疑，但是Yang等［14］认为在众多肿瘤发展过程中，野生型p53等位基因的杂合性缺失（而不是纯合性缺失）诱导了胰腺癌的发生。他们在体外培养3种不同 p53基因型 （p53＋／－，p53－／－和p53R172H／＋）的小鼠胰腺癌细胞系，当通过敲除Atg5或采用氯喹抑制自噬时，这3种细胞系的克隆均受到抑制，即无论p53是否发生突变或缺失，抑制自噬对肿瘤的生长均起到抑制作用。更重要的是，羟氯喹还可有效抑制小鼠体内人胰腺癌移植瘤的生长，而这些移植瘤均伴有Kras和p53突变。这种矛盾的研究结论可能是由二者运用的小鼠模型不同造成，所以建立的动物模型不同会影响研究结果。

4　自噬与胰腺癌化疗

许多化疗药物可提高肿瘤细胞内的自噬水平，其机制可能包括：通过激活p53，继而增加自噬相关蛋白（如 AMPK，DAPK1，TSC2，ULK1／2）表达以促进自噬活性［15］；通过增加 Beclin-1、VMP1的表达或促进Vps34的激活以诱导自噬发生［16］。根据细胞类型的不同，具体作用机制也存在差异。自噬水平的升高既能促进也能拮抗化疗药物的抗肿瘤作用。在胰腺癌的化疗实验中也存在类似的现象。

4.1　自噬促进化疗药物的抗胰腺癌作用

Mukubou等［17］用吉西他滨处理胰腺癌细胞，细胞内自噬水平提高，当吉西他滨联合放疗后，自噬水平得到进一步提高。当用低剂量3-甲基腺嘌呤短时间处理胰腺癌细胞时，既能有效抑制自噬，又不会影响肿瘤细胞增殖。在用该剂量的3-甲基腺嘌呤联合吉西他滨处理胰腺癌细胞时，吉西他滨的IC50升高，表明抑制自噬能减弱吉西他滨的抗肿瘤作用。Pardo等［18］也证实，吉西他滨可以通过VMP1上调胰腺癌细胞内自噬而促进细胞凋亡，当用3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，吉西他滨的促凋亡作用明显减弱。Fiorini等［19］发现豹蛙酶（onconase）可通过 Beclin-1提高胰腺癌细胞内自噬水平，从而诱导胰腺癌细胞的凋亡和生长抑制，氯喹和3-甲基腺嘌呤可明显减弱豹蛙酶的促凋亡和生长抑制作用。而豹蛙酶诱导自噬的同时增加了细胞内ROS生成，与Yang等［8］的研究结果不同，升高的ROS却可通过激活Akt／mTOR通路对自噬产生拮抗作用，从而逃避豹蛙酶诱导的自噬性死亡。更重要的是，豹蛙酶和吉西他滨联合应用可明显增强吉西他滨的促凋亡和生长抑制作用，且联合用药可减少吉西他滨的剂量及其导致的毒副反应。

虽然大量体内外实验均显示，单纯应用自噬抑制剂（氯喹、羟氯喹或3-甲基腺嘌呤）可抑制胰腺癌的生长［8－9，14］，但当抗肿瘤药物引起肿瘤细胞内自噬水平进一步升高时，此时抑制自噬却可促进肿瘤的存活［17－19］。所以可认为胰腺癌细胞内基础水平的自噬较正常胰腺细胞高，对于肿瘤细胞来说，其已适应该水平的自噬，且该水平的自噬可通过提供营养物质和能量维持肿瘤生长，但是当受到化疗药物等应激刺激时，肿瘤细胞内会产生更高水平的自噬作为对应激刺激的初级应答，随后过度激活的自噬可能触发细胞凋亡。

4.2　自噬抑制化疗药物的抗胰腺癌作用

化疗药物诱导的自噬既可触发肿瘤细胞凋亡，也可作为肿瘤细胞抗凋亡的促生存机制。Hashimoto等［20］发现吉西他滨和5-氟尿嘧啶在抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖的同时可诱导细胞内自噬水平升高，氯喹可明显增强吉西他滨或5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞生长的抑制作用。他们认为，细胞内激活的自噬作为对化疗药物的防御机制起到了细胞保护作用，而不是促凋亡作用。另外，肿瘤组织中肿瘤干细胞的残留增加了肿瘤治疗后复发的风险，且胰腺癌中肿瘤干细胞含量增多与肿瘤的化疗抵抗、远处转移和不良预后有关［21－22］。除了胰腺癌细胞，胰腺癌干细胞中自噬水平也显著升高，这有助于肿瘤干细胞在缺氧环境中的存活［23］。Yang等［24］发现用基因敲除或氯喹等手段抑制自噬后，胰腺癌肿瘤干细胞和胰腺癌细胞的生长均受到明显抑制，小鼠体内移植瘤生长也明显被抑制。这表明与胰腺癌细胞相似，肿瘤干细胞同样需要自噬维持自身的活动。更重要的是，当用氯喹或基因敲除抑制自噬后，吉西他滨对肿瘤干细胞及小鼠体内移植瘤的生长抑制作用明显增强。

然而，氯喹也可通过非自噬依赖性通路对肿瘤干细胞产生抑制作用。趋化因子C-X-C chemokine ligand 12（CXCL12）及其受体CXCR4组成的信号转导通路与肿瘤的生长、侵袭、转移密切相关［25］。胰腺癌中CXCL12／CXCR4通路扮演着重要的角色，CXCR4表达阳性的上皮性肿瘤干细胞可顺浓度梯度迁移至CXCL12高表达的器官（如肺、骨、肝脏等）［26］。Hedgehog信号通路在维持肿瘤干细胞自我更新、转移中发挥重要作用［27］。Balic等［28］的实验显示，低浓度氯喹可抑制胰腺癌细胞系的自噬，但是对肿瘤干细胞的自噬无明显影响。体内、外实验均已证实，氯喹可同时减少细胞膜表面CXCR4的表达和Hedgehog通路中PTCH、SMO、GLI1等蛋白的表达，从而抑制 CXCL12／CXCR4和 Hedgehog两条通路介导的肿瘤细胞增殖、迁移及其在肝脏的定植。对乳腺癌和结肠癌的研究显示，自噬可拮抗5-氟尿嘧啶诱导的细胞周期阻滞作用，氯喹可通过激活抑癌基因p53及其下游基因p21、p27而诱导G1期细胞周期阻滞，从而增强 5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用［29－30］。由此可见，不同药物可通过不同机制上调细胞内自噬，而自噬又可通过不同机制对药物起反作用。

5　结论与展望

自噬在胰腺癌发展及治疗中扮演着复杂的角色，尽管单纯抑制自噬可抑制胰腺癌细胞生长，但当自噬抑制剂联合化疗药物抗肿瘤时，却产生了相反的作用。这种现象与自噬抑制剂的非特异性作用及其与化疗药物的不同作用机制有关。所以，探索自噬特异性抑制剂并阐明其与其他抗肿瘤药物在胰腺癌中的相互作用机制，将为胰腺癌的临床治疗提供新的方法及思路。

［参考文献］

［1］Deter RL，De Duve C.Influence ofglucagon，an inducer of cellular autophagy，on some physical properties of rat liver lysosomes［J］.J Cell Biol，1967，33（2）：437－449.

［2］Yla-Anttila P，Vihinen H，Jokitalo E，et al.3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum［J］.Autophagy，2009，5（8）：1180－1185.

［3］Levine B，Mizushima N，Virgin HW.Autophagy in immunity and inflammation［J］.Nature，2011，469（7330）：323－335.

［4］Itakura E，Kishi C，Inoue K，et al.Beclin 1 forms two distinct phosphatidylinositol 3-kinase complexes with mammalian Atg14 and UVRAG［J］.Mol Biol Cell，2008，19（12）：5360－5372.

［5］Lee JW，Park S，Takahashi Y，et al.The association of AMPK with ULK1 regulates autophagy［J］.PLoSOne，2010，5（11）：e15394.

［6］Réz G，Tóth S，Pálfia Z.Cellular autophagic capacity is highly increased in azaserine-induced premalignant atypical acinar nodule cells［J］.Carcinogenesis，1999，20（10）：1893－1898.

［7］Fujii S，Mitsunaga S，Yamazaki M，et al.Autophagy is activated in pancreatic cancer cells and correlates with poor patient outcome［J］.Cancer Sci，2008，99（9）：1813－1819.

［8］Yang S，Wang X，Contino G，et al.Pancreatic cancers require autophagy for tumor growth［J］.Genes Dev，2011，25（7）：717－729.

［9］Kim SE，Park HJ，Jeong HK，et al.Autophagy sustains the survival of human pancreatic cancer PANC-1 cells under extreme nutrient deprivation conditions［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，463（3）：205－210.

［10］Komatsu M，Waguri S，Chiba T，et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice［J］.Nature，2006，441（7095）：880－884.

［11］Wolpin BM，Rubinson DA，Wang X，et al.PhaseⅡand pharmacodynamic study of autophagy inhibition using hydroxychloroquine in patients with metastatic pancreatic adenocarcinoma［J］.Oncologist，2014，19（6）：637－638.

［12］Rosenfeldt MT，O′prey J，Morton JP，et al.p53 status determines the role of autophagy in pancreatic tumour development［J］.Nature，2013，504（7479）：296－300.

［13］Nigro JM，Baker SJ，Preisinger AC，et al.Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumour types［J］.Nature，1989，342（6250）：705－708.

［14］Yang A，Rajeshkumar NV，Wang X，et al.Autophagy is critical for pancreatic tumor growth and progression in tumors with p53 alterations［J］.Cancer Discov，2014，4（8）：905－913.

［15］Feng Z.p53 regulation of the IGF-1／AKT／mTOR pathways and the endosomal compartment［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，2（2）：a001057.

［16］Notte A，Leclere L，Michiels C.Autophagy as amediator of chemotherapy-induced cell death in cancer［J］.Biochem Pharmacol，2011，82（5）：427－434.

［17］Mukubou H，Tsujimura T，Sasaki R，et al.The role of autophagy in the treatment of pancreatic cancer with gemcitabine and ionizing radiation［J］.Int J Oncol，2010，37（4）：821－828.

［18］Pardo R，Lo RéA，Archange C，etal.Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells［J］.Pancreatology，2010，10（1）：19－26.

［19］Fiorini C，CordaniM，Gotte G，etal.Onconase induces autophagy sensitizing pancreatic cancer cells to gemcitabine and activates Akt／mTOR pathway in a ROS-dependentmanner［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1853（3）：549－560.

［20］Hashimoto D，Blauer M，Hirota M，et al.Autophagy is needed for the growth of pancreatic adenocarcinoma and has a cytoprotective effect against anticancer drugs［J］.Eur JCancer，2014，50（7）：1382－1390.

［21］Hermann PC，Huber SL，Herrler T，et al.Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer［J］.Cell Stem Cell，2007，1（3）：313－323.

［22］Van Den Broeck A，Gremeaux L，Topal B，et al.Human pancreatic adenocarcinoma contains a side population resistant to gemcitabine［J］.BMCCancer，2012，12：354.

［23］Rausch V，Liu L，Apel A，et al.Autophagymediates survival of pancreatic tumour-initiating cells in a hypoxic microenvironment［J］.J Pathol，2012，227（3）：325－335.

［24］Yang MC，Wang HC，Hou YC，et al.Blockade of autophagy reduces pancreatic cancer stem cell activity and potentiates the tumoricidal effect of gemcitabine［J］.Mol Cancer，2015，14：179.

［25］Chatterjee S，Behnam Azad B，Nimmagadda S.The intricate role of CXCR4 in cancer［J］.Adv Cancer Res，2014，124：31－82.

［26］Domanska UM，Kruizinga RC，Nagengast WB，et al.A review on CXCR4／CXCL12 axis in oncology：no place to hide［J］.Eur JCancer，2013，49（1）：219－230.

［27］Bailey JM，Mohr AM，Hollingsworth MA.Sonic hedgehog paracrine signaling regulates metastasis and lymphangiogenesis in pancreatic cancer［J］.Oncogene，2009，28（40）：3513－3525.

［28］Balic A，Sorensen MD，Trabulo SM，et al.Chloroquine targets pancreatic cancer stem cells via inhibition of CXCR4 and hedgehog signaling［J］.Mol Cancer Ther，2014，13（7）：1758－1771.

［29］Loehberg CR，Thompson T，Kastan MB，et al.Ataxia telangiectasia-mutated and p53 are potential mediators of chloroquine-induced resistance tomammary carcinogenesis［J］.Cancer Res，2007，67（24）：12026－12033.

［30］Sasaki K，Tsuno NH，Sunami E，et al.Chloroquine potentiates the anti-cancer effect of 5-fluorouracil on colon cancer cells［J］.BMC Cancer，2010，10：370.