培养基血清质量和浓度的不同对肠干细胞群分离培养的影响

刘冠琳，程跃，谢国海，严泽军，袁鹤胜

作者单位： 315010宁波，宁波大学附属宁波市第一医院，宁波市泌尿系疾病转化医学研究重点实验室

哺乳动物的小肠黏膜上皮是机体营养物质吸收的主要场所，肠黏膜上皮终生进行着不间断的自我更新，因为位于肠道隐窝部位的干细胞保持着旺盛的增殖分化能力。凋亡脱落及受损坏死的细胞与干细胞增殖、分化之间保持着动态平衡，由此可见肠道干细胞在维持肠道屏障结构和功能完整以及损伤后的修复中扮演着重要角色。因此，利用体外培养技术对肠干细胞进行原代培养，有助于进一步了解影响肠道干细胞增殖和分化的因素及机制，对临床治疗肠道损伤和某些代谢性疾病（如泌尿系结石）将有重要的意义[1-3]。血清的质量和浓度对原代细胞的贴壁和生长有着相当大的影响，本实验通过对常用血清和其浓度进行筛选，拟找到相对适合肠干细胞群分离培养的血清种类及最佳浓度。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 发情期昆明系小白鼠6只，雌性4只，雄性2只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，2：1同笼交配，阴栓检出日记为受孕第1天。

细胞培养基为用于细胞生长的液体培养基。具体配制方法为：DMEM培养液中加入新生牛血清或胎牛血清（均购自GIBYCO公司），血清的浓度分别为5%、10%、15%及20%。除此以外，8种培养基中还含有以下成分，表皮生长因子20ng/ml，胰岛素2g/ml，谷氨酰胺2 mmol/ml，青霉素及链霉素各100 U/ml。酶消化液的配制：本实验中肠干细胞的分离采用酶消化法，所用的酶消化液含有2种成分：透明质酸酶（购自Sigma公司，工作液浓度为100 U/ml），Ⅺ型胶原酶（购自Sigma公司，工作液浓度为300U/ml）。

细胞清洗液的配制：细胞清洗液采用加入了5%新生牛血清的DMEM培养液。

1.2 实验方法

1.2.1 肠干细胞群的分离和培养 取孕17d昆明系小白鼠，采用断颈法处死，先打开腹腔取出胚胎置于无菌培养皿中。而后打开胎盘取出胚胎鼠肠组织，置于细胞清洗液中，去除肠系膜，经反复清洗（3次）后剪碎肠组织。将剪碎的肠组织用酶消化液进行消化，20 min后采用离心法(1 000 r/min，5 min)终止消化；然后通过反复沉降（5次，1 min/次），去除绝大多数成纤维细胞和平滑肌细胞等杂质细胞；最后，将通过离心（1 000 r/min，5 min）获得的细胞分别用8种细胞培养基溶解，种植于同一24孔板中（购自Corning公司），放置在二氧化碳恒温箱内培养。48h后进行第1次换液，以后每72小时换液1次。连续观察、记录细胞生长情况。封二彩图1为经分离后得到的肠绒毛细胞团悬浮液，图中可见分离出的单个细胞及肠绒毛细胞团。

1.2.2 肠干细胞群的鉴定 将所得的原代细胞传5代后（约25d），将细胞转至事先装有盖玻片的24孔板中，行细胞爬片，每72小时换液1次。7 d后，固定细胞（固定液由丙酮和无水乙醇按1∶1配制）。将所得细胞爬片用角蛋白18亚型抗体及波形蛋白抗体（购自Sigma公司）行免疫组化染色，以鉴定细胞的组织来源。

2 结果

2.1 肠干细胞群的形态及生长方式 24～48h后，细胞开始贴壁生长。显微镜下可见，除采用10%新生牛血清组外，其他组细胞均含有大量呈梭状的间质细胞，上皮细胞所占比例不足5%（封二彩图2）。而采用含10%的新生牛血清培养基培养，则贴壁生长的细胞绝大部分为上皮细胞。上皮样细胞呈集落状生长，主要有三种集落。其中，由典型上皮构成的集落约占30%（封二彩图3），由扁平上皮细胞构成的集落约占20%（封二彩图4），2种细胞混合生长的集落约占50%。

血清浓度为10%时，肠干细胞群在第3、4代达到生长分化的顶峰；而后干细胞逐渐减少，成熟的肠上皮细胞逐渐增多，直至最终凋亡。经1个多月的培养，传至第7～8代，肠干细胞群开始凋亡。上皮细胞在传代生长的过程中，细胞形态逐渐改变，有些细胞在形态上类似于成纤维细胞等间质细胞，但角蛋白18亚型抗体染色为阳性。而其他组的细胞，可一直持续生长，但经过传代，上皮细胞仍会逐渐减少。

2.2 肠干细胞群的鉴定 将采用含 10%的新生牛血清培养基培养出的肠干细胞群传至第5代后，将获得的细胞行细胞爬片后用角蛋白18亚型抗体（购自Sigma公司）行免疫组化染色，结果为阳性（封二彩图5），而用波形蛋白抗体染色，其结果为阴性。同时，由于培养出的细胞群能进行5次以上的传代，说明所培养的细胞中含有大量的有功能的肠干细胞。而其他组的细胞做相同的处理后，用角蛋白18亚型抗体行免疫组化染色，结果为阴性，而用波形蛋白抗体染色，其结果为阳性。

3 讨论

肠干细胞是位于小肠黏膜隐窝底部的未分化细胞，它以对称分裂和不对称分裂两种方式来维持隐窝内稳定的干细胞数量,并通过短暂扩增细胞，增殖分化成5种不同表型的终末细胞，即潘氏细胞、杯状细胞、内分泌细胞、肠吸收细胞和M细胞[4-5]。肠干细胞群的构建对进一步研究肠损伤和某些代谢性疾病（如泌尿系结石）有着重要的意义。原代细胞培养，最为困难的环节就是细胞的纯化。以往国外文献报道中，小鼠肠干细胞群的构建，所得细胞群多为间质细胞和上皮细胞混和生长。这样培养出来的细胞群固然有利于研究肠黏膜上皮的生长分化机制，但却给肠干细胞本身的研究以及基因治疗方法的探索造成了不小的困难。就当前的技术条件而言，获得绝对纯的肠干细胞是不可能的。但即使获得组织学上相对纯化的肠干细胞群，对进一步的研究也十分有意义。

血清的质量和浓度对原代细胞的贴壁和生长有着相当大的影响[6]，选择合适的血清质量和浓度有着十分重要的意义。国外相关文献报道中，肠干细胞群的构建一般采用的是10%的小牛血清[7]，如前所述，效果不甚理想。本研究通过对胎牛血清和新生牛血清的几种常用血清浓度进行筛选，发现细胞培养基采用10%的新生牛血清时，贴壁细胞绝大部分为成集落状生长的上皮细胞，与国外报道的细胞形态基本符合，但杂质细胞却很少见到。由此可见，采用含10%新生牛血清的细胞培养基进行肠干细胞群的构建可以获得较为纯化的肠干细胞群。当然，具体机制还有待进一步研究。

目前，肠道干细胞生物学研究仍存在一个缺憾，即还没有一种得到公认的、能用于分离和培养肠干细胞的特异性标志物。因此，本实验只能通过细胞形态学、功能状况以及免疫组化等3个方面综合进行细胞鉴定。如前所述，本次实验所培养出的细胞就形态学而言，已出现与国外文献报道基本符合的3种细胞集落。就功能而言，细胞能存活1个月以上，且至少能传7～8代，这说明细胞群中必然含有大量的干细胞。国外相关文献报道，角蛋白18亚型在肠干细胞所在集落中特异性表达[7]。将传代后的细胞进行细胞爬片，行免疫组化染色，角蛋白18亚型抗体染色为阳性，说明细胞的组织学来源没有错误。由于间质细胞波形蛋白染色多表现为阳性，所以本研究中对所有的细胞均进行波形蛋白染色，结果显示，其他组细胞染色均为阳性，而采用10%的新生牛血清培养的细胞染色结果为阴性，这更进一步证明所获得的细胞组织学来源的正确性。

综上所述，肠干细胞群的构建可以达到在组织学上的纯化，这不仅仅是一种方法学上的改进，对于肠干细胞本身的研究以及基因治疗方法的探索都有着重要的意义。