免疫性血小板减少症患者 CD19+CD24highCD27+及CD24highCD27+CD38highB调节细胞的表达

费菊萍，寿黎红，董晓辉，曹丹，方遒，徐伟来，韦菊英，刘辉

B调节细胞（Breg）是一组诱导免疫耐受的免疫抑制细胞，其通过产生白介素10、白介素35、转化生长因子b（TGF-b）等细胞因子抑制病理性T细胞及其他炎症前淋巴细胞的扩增，从而抑制病理性的免疫过程。不同的炎症环境诱导产生不同的Breg细胞，目前人体中已鉴定出 CD24highCD27+[1]、CD19+CD24highCD27int[2]、CD19+CD24highCD38high[3]、CD19+CD25highCD71high[4-5]等多种Breg细胞，在感染、结缔组织病等中具有重要作用。为了研究 Breg细胞在免疫性血小板减少症（ITP）中的作用，笔者检测了 CDl9+CD24highCD27+细胞及 CD24highCD27+CD38high细胞在ITP患者外周血中的数量，以探讨Breg细胞在ITP中的作用。报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 收集2015年7月至2017年12月浙江省湖州市中心医院和浙江大学医学院附属第一医院收治的ITP患者80例，其中男33例，女47例；年龄16～80岁，中位年龄41岁。诊断和分期标准按成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）[6]。对照组为45例本院同期健康志愿者。

1.2主要试剂 CD19 FITC、CD27 APC及CD24 PE单抗均购自美国BD公司，CD38PE-CY7单抗购自美国beckman coulter公司。

1.3方法 取外周血标本 2 m l，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用流式细胞仪（FACS）检测表型为CD19+CD24highCD27+及 CD24highCD27+CD38high细胞。检测步骤：（1）取适量CD19、CD24、CD27 和CD38单抗，加入上样管中和100l外周血，轻轻振荡混匀，孵育15min；（2）加入2m l氯化铵裂解液的工作液，振荡均匀，作用 10min，1500 r/min 离心 5min，去上清；（3）加入100l磷酸盐缓冲液（PBS）重悬后上机检测。

1.4统计方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用 检验，＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CD19+CD24highCD27+表型细胞及CD24highCD27+CD38high表型Breg细胞的测定 首先通过前向角散射（FSC）及侧向角散射（SSC）两个参数圈门标记出淋巴细胞群，应用 FSC参数和 CD19单抗标记出CD19+B淋巴细胞，通过CD24单抗及CD27单抗从CD19+B淋巴细胞标记出CD24highCD27+细胞，最后通过 CD38单抗从 CD24highCD27+淋巴细胞标记出CD24highCD27+CD38high细胞（封二彩图 1）。

2.2CD19+CD24highCD27+Breg细胞在ITP患者的表达 ITP患者的CD19+CD24highCD27+细胞占CD19+淋巴细胞百分数为（14.167 4±12.1）%，对照组为（33.053 8±10.3）%，ITP患者组低于正常对照组（=6.487=0.000）。见封二彩图2。

2.3CD24highCD27+CD38highBreg细胞在ITP患者中的表达 ITP患者的 CD24highCD27+CD38highBreg细胞占 CD19+细胞的中位数为 0.63%，均值为（1.28±1.56）%，而占CD19+CD24highCD27+细胞中位数6.725%，均数为（8.3775±8.02）%。

3　讨论

Breg细胞又被称为B10细胞，通过分泌白细胞介素10（IL-10）和肿瘤生长因子-（TGF-）等细胞因子，抑制Th1、CD8+细胞毒T细胞、DC细胞、单核细胞及Th17等细胞或刺激Tr1、Foxp3+Treg细胞（抑制性T细胞）发挥免疫调节功能。大多数B10细胞同时表达CD24和CD27，新鲜外周血中IL-10+B10细胞主要存在于 CD24high或 CD27+B细胞亚群中，CD24highCD27+B细胞占外周血 B淋巴细胞25%左右。LPS+PIB刺激5h，CD24highCD27+亚群产生IL-10的能力是 CD24lowCD27－B细胞的10倍以上；而CD40L、LPS、LPS+CD40L、CpG 或 CpG+CD40L 刺激72h，CD24highCD27+B细胞分泌IL-10的能力亦显著优于CD24lowCD27－B细胞，说明B10细胞及其前体细胞均存在于CD24highCD27+亚群中，属于CD24highCD27+B细胞的一个亚群[7]，CD24highCD27+B细胞转化为CD24highCD27+CD38highBreg细胞需要细胞因子的刺激。本研究显示，健康对照CD24highCD27+细胞占外周血CD19+B淋巴细胞的33%，CD24highCD27+CD38highBreg细胞仅占CD19+B淋巴细胞的1%左右，可能与检测前未予CD40L、LPS或CpG等刺激有关。

Breg细胞功能缺陷或数量异常在自身免疫性疾病发生中具有重要作用。Blair等[1]研究证明，系统性红斑狼疮（SLE）患者的CD19+CD24highCD38high细胞与健康人相比，其产生IL-10的能力及抑制T细胞因子产生的能力均受到损害，表明SLE患者Breg的功能有缺陷。Flores-Borja等[3]发现，在类风湿关节炎（RA）患者CD19+CD24highCD38highB细胞不能将CD4+CD25－T细胞转化为Treg细胞或抑制T(H)17的发展，但却保持了抑制T(H)1细胞分化的能力，活动性RA患者外周血CD19+CD24highCD38highB细胞数量减少，是引起RA的重要原因。本研究发现ITP患者外周血CD19+CD24highCD27+细胞数显著低于健康对照组，提示ITP患者可能存在Breg细胞数量异常。Li等[8]发现慢性ITP患者CD19+CD24highCD38highBreg细胞数量减少及其功能的下降，IL-10的表达及TNF-的抑制作用减弱。徐伟来等[9]发现新诊断ITP患者、持续或慢性ITP患者的CDl9+CD24highCD27+细胞均低于健康对照组，说明Breg细胞异常是ITP发生的重要机制之一。

综上所述，CD19+CD24highCD27+细胞与CD24highCD27+CD38high细胞是人外周血中重要的Breg细胞，ITP患者存在CD19+CD24highCD27+细胞数量减少与功能缺陷，与ITP的发生可能有关。

参考文献：