细胞内DNA识别受体与反转录病毒感染

刘 月，宋 迪，崔钰晗，王 洁

(新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453000)

反转录病毒感染过程中非常重要的一个环节是DNA反转中间体的产生并整合入宿主细胞的染色体中，而DNA反转中间体可以被细胞内DNA识别受体所识别，从而诱导Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)的产生以及其他抗病毒应答反应，达到抑制病毒复制并最终清除病毒的目的。本文主要综述反转录病毒感染过程中细胞内DNA识别受体对反转录病毒感染的影响。

1 固有免疫应答反应

固有免疫对入侵病原体的识别和调控是近年来免疫学研究的热点领域。固有免疫系统主要通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)来识别各种病原体[1]。机体内现已发现6种PRR家族：Toll样受体家族、核苷酸寡聚结合域(nucleotide binding oligomerization domain,NOD)样受体家族、细胞内RNA识别受体家族、细胞内DNA识别受体家族、C类凝集素受体家族及其他固有免疫特异性PRR[2]。这些PRR有些存在于细胞表面，有些存在于细胞质内，通过与选择性或特定性的信号分子结合而激活不同的信号转导通路，实现对不同病原体的固有免疫调控。

目前，DNA引起固有免疫反应的具体机制尚未完全清楚。近年来，病毒DNA识别受体的鉴定和机制研究取得了一些突破性的进展[3]，然而对于反转录病毒与固有免疫反应的相互作用和调节机制的研究还略显滞后。研究显示，反转录病毒可以通过各种PRR选择性地引发一系列固有免疫反应。某些细胞内DNA识别受体可以检测到反转录病毒的入侵，如环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS)、γ干扰素诱导蛋白16(gamma-interferon-inducible protein 16，IFI16)及Ku70等DNA识别受体在反转录病毒感染期间可以诱导IFN抗病毒免疫应答和炎症反应的产生，在某些细胞中还能够触发细胞凋亡机制，使反转录病毒感染细胞凋亡，进一步抑制反转录病毒感染[4]。

2 反转录病毒感染

反转录病毒是RNA病毒的一种，其遗传信息主要储存在RNA上。反转录病毒感染时，首先在其自身携带的反转录酶的作用下将RNA转变为cDNA，新合成的cDNA插入宿主的核DNA中，随宿主DNA复制、转录、翻译而扩增，可表现为人和多种动物的恶性肿瘤和免疫缺陷病[5]。由此可见，反转录过程中产生的反转录病毒DNA中间体对反转录病毒感染的初始识别至关重要。

反转录病毒复制包括几个不同的阶段。反转录病毒感染的第1步涉及病毒包膜糖蛋白与宿主细胞上的细胞表面受体之间的特异性相互作用。病毒包膜与靶细胞膜的相互作用使病毒侵入细胞，病毒完成脱包膜并把病毒核心颗粒释放到细胞质中[6]。病毒DNA合成是反转录病毒感染的核心过程，一般在感染细胞的细胞质中开始。在反转录复合物中，病毒单链RNA(single-stranded RNA，ssRNA)通过反转录酶作用，产生反转录病毒双链DNA(double stranded DNA，dsDNA)[7]。反转录过程中的酶促反应是由反转录酶的2种不同的酶活性促进：(1)通过将合适的脱氧核糖核苷酸三磷酸掺入RNA或DNA模板中来延长引物的DNA聚合酶；(2)特异性降解RNA/DNA杂合体的RNA链的核糖核酸酶H活性。在细胞质中合成后，病毒反转录产物迁移至细胞核，在细胞核内作为前病毒模板整合到细胞基因组中[8-9]。通过从人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV-1)感染细胞的细胞质中分离复制核蛋白复合物显示，复合物含有线性病毒DNA和整合酶，后者则是唯一能检测到的蛋白，这些观察表明整合酶是HIV-1整合前复合物的组成部分，且整合酶可能是整合反转录病毒DNA所需的唯一病毒蛋白[10]。

3 反转录病毒与DNA识别受体

固有免疫系统主要通过识别病毒核酸来感知病毒。一般有2种感知病毒核酸的模式[11]：(1)直接识别进入细胞质内的反转录病毒的ssRNA，如Toll样受体7/8可以直接识别反转录病毒的ssRNA；(2)识别病毒复制过程中产生的DNA中间体。因此，被感染的细胞可以通过细胞质中存在的PRR来识别病毒复制时产生的病毒核酸，包括RNA识别受体[12]和DNA识别受体[13-15]。PRR的参与导致促炎细胞因子和Ⅰ型IFN转录激活。Ⅰ型IFN和相邻细胞上的Ⅰ型IFN受体结合，通过信号传导，促进IFN刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)的表达，从而阻断病毒复制和传播[14-15]。

3.1cGAS识别受体研究显示，用细胞溶质病毒DNA刺激细胞，通过cGAS促使环磷腺苷合成新型的第二信使环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP)，cGAMP通过结合和激活干扰素相关基因刺激因子(stimulator of IFN genes，STING)的方式刺激Ⅰ型IFN产生[16-17]。cGAS缺失可以抑制反转录病毒感染引发的固有免疫应答反应，因此，cGAS是反转录病毒的关键识别受体[18]。HIV-1、鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)以及人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型(human T lymphotropic virus typeⅠ，HTLV-1)等反转录病毒均可激活cGAS产生cGAMP，随后结合并激活STING和Ⅰ型IFN应答。通过敲除小鼠或人细胞系中的cGAS可阻断HIV、MLV和SIV感染所诱导的细胞因子的产生。另外，针对HIV反转录酶的抑制剂可以阻断HIV病毒感染诱导的IFN-β的产生，这表明HIV病毒反转录出的DNA对触发固有免疫反应非常关键。研究表明，将HeLa细胞与MT2细胞(HTLV-1阳性T细胞系)共培养后，HeLa细胞中cGAS表达升高，而在HeLa细胞中过表达cGAS后，干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和p65的磷酸化水平升高，IFN-β、肿瘤坏死因子-α表达增加，HTLV-1病毒蛋白表达下降。这些结果表明cGAS在HTLV-1感染的HeLa细胞中可能具有促进固有免疫应答并抑制HTLV-1病毒复制的功能[19]，cGAS是HIV和其他反转录病毒的细胞内识别受体。

3.2γ-干扰素诱导蛋白16(γ-interferon-inducibleprotein16，IFI16) IFI16是一种DNA识别受体，属于PYHIN家族成员，包含2个能够结合DNA的HIN结构域。研究证明，IFI16在识别HIV-1来源的dsDNA中具有重要功能[20]。HIV-1的dsDNA、ssDNA固有免疫应答反应的诱导依赖于DNA结构中的茎环结构，而不是DNA序列，而这种应答反应依赖于IFI16对DNA的识别以及与STING的共定位[21]。将dsDNA或ssDNA转染入原代人巨噬细胞可以激活IFI16-STING-TBK1-IRF3/7途径，沉默巨噬细胞中的IFI16以后，HIV-1感染诱导产生的Ⅰ型IFN水平明显降低，说明IFI16可以识别HIV-1复制周期中产生的DNA序列，通过调节干扰素的产生来影响巨噬细胞中的HIV-1复制[22]。此外，反转录酶活性抑制剂齐多夫定也可以降低IFN应答，表明IFI16识别的是反转录病毒的反转中间体。也有研究表明，小鼠IFI203、IFI204基因是IFI16的同源蛋白，含有2个C-末端Hind结构域，敲除这2个分子以后可明显抑制细胞对DNA的免疫应答反应[23]。STAVROU等[24]研究表明，MLV感染诱导快速 IFN-β 应答，用特异的siRNA处理NR-9456细胞 24 h，并与缺乏病毒糖基化Gag蛋白表达的MLV变体温育2 h，发现 IFI203、cGAS和STING沉默均可降低病毒感染后24 h的IFN-β应答；进一步研究发现，反转录病毒感染细胞后，IFI203由细胞核转移到细胞质，直接与病毒DNA相互作用，启动抗病毒反应。

3.3Ku70识别受体ZHANG等[25]首次证明Ku70是一种新型的细胞内DNA识别受体，在人胚肾293细胞中，Ku70主要借助IRF1和IRF7来诱导Ⅲ型IFN的产生，对Ⅰ型IFN的产生无明显影响。但也有研究表明，在小鼠胚胎成纤维细胞中，Ku70通过STING-TBK1-IRF3信号途径对痘病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株和1型单纯疱疹病毒等多种DNA病毒进行响应，诱导产生Ⅰ型IFN[26]。研究表明，HTLV-1感染可诱导Ku70高表达，Ku70过表达可抑制HTLV-1蛋白表达，而Ku70沉默促进了HTLV-1蛋白表达；另外，Ku70与HTLV-1的DNA反转中间体ssDNA90存在相互作用，ssDNA90刺激能够诱导Ku70表达，且Ku70可以促进ssDNA90触发的固有免疫应答反应；同时还发现，HTLV-1感染增强了Ku70与STING的结合，STING在Ku70介导的抗HTLV-1感染的宿主防御中非常关键[27]。

3.4DExD/H盒解螺旋酶41(DExD/H-boxhelicase41，DDX41) DEXDc解旋酶家族成员DDX41是髓系来源的树突状细胞(myeloid dendritic cells，mDC)中的细胞内DNA识别受体。研究表明，利用shRNA沉默DDX41后可以显著抑制mDC对DNA和DNA病毒的固有免疫应答反应；DDX41和STING过表达在促进IFN-β启动子活性方面具有协同效应，DDX41结合DNA和STING并与STING在细胞质中一起定位，沉默DDX41表达则能阻断B型DNA激活TBK1、核因子κB和IRF3[28]。LEE等[29]研究表明，Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton tyrosine kinases，BTK)与STING和DDX41相互作用，BTK磷酸化DDX41，BTK在激活DDX41和STING信号传导中起关键作用。STAVROU等[30]研究证明，DDX41可识别MLV病毒核酸，激活STING信号，导致IRF3生产增加，诱导IFN产生。

3.5STINGSTING在固有免疫中发挥着重要作用，几乎所有的DNA受体均要通过STING蛋白将信号向下游传递。同时，STING也可直接或间接识别DNA。SZE等[31]研究发现，在HTLV-1刺激的单核细胞中，磷酸化的信号转导和激活转录因子1、磷酸化IRF3、ISG56表达增强，而用siRNA沉默STING后，磷酸化IRF3、ISG56以及Bax表达明显下降；进一步发现，STING与HTLV-1的反转中间体ssDNA90或dsDNA90在原代培养的单核细胞中有直接的相互作用；这说明STING通过识别反转录病毒的反转中间体而激活IRF3，从而诱导Ⅰ型IFN的免疫应答反应；同时还发现，在转染了ss/dsDNA90的细胞中，STING可以促进IRF3-Bax凋亡复合物的形成，从而诱导线粒体依赖性细胞凋亡。

4 结束语

细胞对反转录病毒的抗病毒固有免疫应答反应仍有很大的研究空间，例如，DNA识别受体是否可以区分不同的反转中间体，不同DNA识别受体对病原体识别的相对贡献如何，它们之间是否存在协同作用等。值得注意的是，敲除这些DNA识别受体中的任何一个均会影响Ⅰ型IFN产生，表明这些DNA识别受体在反转录病毒感染诱发的抗病毒固有免疫信号传导中均具有重要作用。敲除IFI16、cGAS或STING均可以增加人单核细胞中HIV-1的复制，表明这些DNA识别受体在控制髓系来源细胞中HIV复制方面发挥着至关重要的作用[32]。由于IFI16、cGAS、Ku70及DDX41这些DNA识别受体均使用接头蛋白STING，它们介导的DNA识别与下游信号通路之间可能存在交叉反应。这些识别受体在不同的反转录病毒感染不同的细胞中的功能仍有待进一步研究。抗病毒固有免疫应答反应对即时抑制反转录病毒的复制和扩散至关重要，而适应性免疫应答对消除病毒感染和长期免疫记忆至关重要。了解反转录病毒感染与DNA识别受体的关系，有利于感染者在病毒感染初期做出有效的应对措施。有研究表明，IFI16不仅通过STING诱导Ⅰ型IFN应答反应，还诱导CD4+T细胞中分泌白细胞介素-1β[33]。该项研究不仅揭示了IFI16在感知HIV-1复制中间体中的新作用，还强调了通过相同识别受体在不同细胞类型中激活下游的抗病毒和细胞死亡途径的差异。将先天性免疫与适应性免疫结合，详细了解人体免疫机制可能有助于发现精确治疗靶点，对新型治疗药物的研发、阻断反转录病毒复制、诱导感染细胞凋亡或死亡有重要意义。