鸡新城疫免疫防制探讨

罗 薇

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒感染禽类所致的一种高度接触性传染病.OIE规定一旦发生新城疫必须报告，我国农业部将此病列为一类疫病，属国家中长期疫病防治规划中优先防治的5种一类疫病之一.新城疫的防控主要依靠疫苗免疫，以防止易感禽被感染.新城疫的有效免疫需综合考虑免疫对象及其养殖环境，选择有效的疫苗，制定合理的免疫程序.本文将从新城疫病毒的毒力、疫苗种类、免疫接种及其影响因素等方面对鸡新城疫免疫防制相关问题进行论述，旨在为临床有效防控鸡新城疫提供参考.

1 鸡新城疫病毒的毒力

2002年国际病毒分类委员会（ICTV）将鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）归类于副粘病毒科（Paramyxoviridae）的成员[1]，病毒全基因长约 15.0 kb，为不分节段单股负链RNA，病毒粒子由脂质双分子层包裹，包括 NP、P、M、F、HN、L 等6个结构蛋白，与新城疫毒力强弱相关的主要蛋白是 F和 HN[2].NDV仅有一个血清型，但不同毒株毒力差异很大.生物学试验是确定毒力的可靠方法，用1个最小致死量NDV接种10日龄鸡胚，鸡胚死亡平均时间（MDT）≤60 h为强毒，＞90 h为弱毒，介于二者之间为中毒；NDV对1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）0.0～0.5为弱毒，1.0～0.5为中毒，1.5～2.0为强毒；NDV对6周龄鸡静脉注射致病指数（IVPI）0.00为弱毒，0.0～0.5为中毒，2.0～3.0为强毒.

鸡新城疫也可根据发病鸡临床症状或死亡情况分五种临床类型.Doyle型或称内脏速发型死亡率高，主要病变为消化道出血，可感染所有日龄的鸡；Beach型也称嗜神经速发型，呈急性、致死性感染，临床以神经和呼吸道症状为主，各日龄鸡均易感；Beaudette型为致病力弱的病毒株感染引起，仅致幼禽死亡；Hitchner型为缓发性病毒引起的隐性或轻微呼吸道感染病型；以及无症状肠型.新城疫病毒毒力差异是因为病毒在复制中，F蛋白及其前体糖蛋白（F0）被合成，F0被裂解分为F1和F2，出现了F蛋白的融合活性，使子代病毒具有传染性，裂解作用由宿主细胞的蛋白酶介导[3].大量研究表明，F0裂解区域112～117aa氨基酸的变异与病毒的毒力强弱密切相关，裂解部位氨基酸序列最低要求是-113RXR/KR∗F117[4-5].速发型和中发型毒株117位是苯丙氨酸，除113位和116位外，还有112位和115位两个碱性氨基酸，能裂解强毒株F0蛋白的多个碱性氨基酸残基位点的蛋白酶，广泛存在于不同宿主组织器官的各类细胞中，速发型和中发型毒株能造成宿主致死性和全身性感染.缓发型毒株的117位为亮氨酸，113位为另一种碱性氨基酸，裂解这类毒株F0蛋白需要胰酶样酶类，此酶只存在于呼吸道和消化道等少数种类的上皮细胞中，因此，这类病毒仅引起呼吸道和消化道的局部感染[4].2000年我国多地区报道了新城疫基因Ⅶ型的流行，导致抗体水平较高的产蛋鸡产蛋量下降，引发抗体水平一般的幼龄鸡和肉鸡出现极高的发病率和死亡率，被认为是新城疫第4次大流行的原因[6].分子分型研究证实，NDV有多个基因型和若干基因亚型，基于NDV F基因序列和F蛋白可变区氨基酸残基变化等，将NDV分为 ClassⅠ和 ClassⅡ两类[7].ClassⅠ的NDV为弱毒[8-10]；ClassⅡ被划分成9个基因型[10]，当前爆发流行者多为基因Ⅶ型，此外我国也存在基因Ⅷ、Ⅸ型的散发[10-13].

2 新城疫免疫途径及影响鸡新城疫免疫效果的因素分析

目前，鸡新城疫的有效防控主要依靠免疫接种.常见的免疫途径有气雾、点眼、滴鼻、饮水、肌肉及颈部皮下注射等.气雾免疫经济且方便，适宜规模化、集约化的养鸡生产，不影响母鸡产蛋，但易引起雏鸡呼吸道的并发症，是国内外研究较多的一种免疫方法.因呼吸道上皮细胞对新城疫病毒敏感性高，气雾免疫时，病毒直接进入呼吸道上皮细胞，在细胞中复制并形成持续性的免疫刺激，产生局部黏膜免疫的同时，刺激鸡体产生体液免疫.饮水免疫适宜大群免疫，鸡群中个体的疫苗摄入量有差异，易出现免疫不均，不适合初次免疫.滴鼻、点眼和注射免疫效果确实，但应激大.尾家等学者发现滴鼻、点眼接种活疫苗后气管黏膜出现了相当于动物IgA的免疫球蛋白.李肇增等用不同方式免疫接种试验鸡，发现血凝抑制（HI）抗体有差异，肌注、皮下注射法血清HI抗体效价最高，滴眼法泪液的抗体效价最高，气雾免疫法血清、泪液、气管的HI抗体效价相似；气雾免疫法较滴鼻法产生的HI抗体高，滴鼻法又较饮水法产生的抗体高且早.

影响新城疫免疫效果的因素众多，如母源抗体、疫苗种类、免疫程序等，其中免疫程序是否合理是非常重要.目前国内尚无可供统一使用的免疫程序.制定免疫程序的原则是既要保证鸡群免疫后安全无疫病，又要尽量减少免疫接种次数.雏鸡免疫器官发育不完善，主要依靠母源抗体抵抗感染，母源抗体可使雏鸡获得对野毒感染的抵抗，但母源抗体会干扰新城疫活疫苗的免疫效果.雏鸡从卵黄中获得母源抗体，并将抗体传给子代[14]，因此母鸡的抗体与子代雏鸡的母抗呈平行关系，出壳后的雏鸡母源抗体峰值在第3～5天，随后逐渐下降，半衰期为4.5天.大约6周雏鸡的免疫器官成熟，免疫能力与成年鸡相当.张友明认为无野毒感染情况下，母鸡免疫后的1～3个月，雏鸡首免日龄应在20天；门常平根据试验选定雏鸡的母源抗体降至4log2为初免阈值，再次免疫时间应根据鸡群新城疫HI抗体水平而定，当新城疫抗体水平的阈值为4log2时，需要再次进行免疫；临床实验中一些养鸡场则将4～6log2定为再免阈值.1973年农林部《兽医生物药品制造及检验规程》建议鸡新城疫的免疫程序:出生雏鸡Ⅱ系苗免疫，1个月后Ⅱ系苗二免，3～4个月再用Ⅰ系疫苗免疫1次增强免疫力.鉴于国内养殖格局的变更，华南农业大学辛朝安建议的鸡新城疫免疫程序较为复杂:1日龄，克隆30或Ⅱ系或Ⅲ系或Ⅳ系弱毒苗点眼、滴鼻；10～15日龄，新城疫灭活油乳剂肌肉或皮下注射（0.3mL～0.5 mL/只），同时用克隆30或Ⅲ系或IV系弱毒疫苗点眼、滴鼻；25～30日龄，克隆30或Ⅲ系或Ⅳ系弱毒疫苗点眼、滴鼻；45～50日龄，Ⅳ系弱毒苗滴鼻、点眼或Ⅰ系疫中强毒活苗肌注；开产前1个月，鸡新城疫油乳剂灭活苗肌肉或皮下注射；开产后，每1～2月用Ⅳ系弱毒疫苗喷雾或滴眼、滴鼻一次；开产中期42～45周龄，作为加强，肌肉或皮下注射油乳剂灭活苗.刘峰对使用不同新城疫免疫程序的免疫鸡群感染NDV强毒，RT-PCR检测NDV核酸表明:新城疫弱毒苗和油乳剂灭活苗同时接种，可使鸡群对NDV强毒的感染率降至最低[15].

3 鸡新城疫疫苗

疫苗免疫是新城疫综合防制的一个重要环节，安全、高效的疫苗是新城疫有效防控的必要保证.临床常用的新城疫疫苗主要有传统的弱毒活苗、灭活疫苗，以及一些新型、正在研发和试验的疫苗，如DNA疫苗、活载体疫苗、基因工程苗、亚单位疫苗和转基因植物疫苗等.

3.1 传统新城疫疫苗

弱毒疫苗分缓发型毒株疫苗和中发型毒株疫苗两种，是养鸡场最常用的疫苗，这类疫苗可经多途径免疫，产生的免疫力较灭活苗快，但运输、保存要求条件较高，有散毒危险.Majiyagbe的试验表明，不论是否进行基础免疫，B1株、LaSota株与 Ulster株相比，Ulster株免疫鸡产生的抗体最低，LaSota株产生的抗体最高[16]，前者多用于雏鸡首免，Bl、LaSota等毒株，通过滴鼻、点眼、气雾等途径免疫，刺激机体产生局部抗体，免疫后能快速保护免疫鸡群，达到良好的免疫保护效果.对于中发型的疫苗如H株、Roakin株等虽免疫原性好且免疫持续期长，但毒力较强，只能用于二免，临床多用于2月龄以上鸡群的加强免疫，此类疫苗被认为有散毒和毒力返强的风险，欧洲国家不使用.2002年李秀云用强毒分离株和强毒参考株F48E8攻击LaSota疫苗免疫鸡，免疫保护效果不理想，推测LaSota疫苗株与目前普遍发生、流行的APMV-Ⅰ毒株的基因型存在差异，不能有效控制家禽 APMV-Ⅰ感染.

新城疫灭活疫苗依据佐剂分油乳苗、蜂胶苗、铝胶苗等，其免疫只能采用注射方式，免疫持续时间较长，主要激发体液免疫，不排毒，无散毒危险，疫苗更加安全，运输、保存方便.由于基因Ⅶ型毒株的致病性强大，汪明等在原新城疫疫苗基础上，添加了流行基因型毒株，研制成了复合型新城疫蜂胶灭活苗，该疫苗能加速相应抗体的产生，并能刺激机体产生良好的细胞免疫，有效控制了新毒株的流行[17].

3.2 新型鸡新城疫疫苗

20世纪中叶，当经典疫苗取得良好成果时，许多兽医工作者继续探索研究一些旨在克服传统疫苗缺点的组分疫苗.新城疫病毒的F和HN蛋白与病毒的感染和致病能力有关，是刺激宿主产生免疫保护的主要抗原成分，能在痘苗病毒、疱疹病毒、火鸡疱疹病毒等载体中获得良好表达，其重组的病毒安全性好，接种鸡能诱导抵抗新城疫强毒致死性攻击的免疫保护力[18-19].1989年Sakaguchi等将NDV的F基因插入质粒载体构建DNA疫苗，免疫家禽9周后方能抵抗致死剂量同类强毒的攻击[20].虽然DNA疫苗不易突变、返祖，安全性好，但疫苗免疫应答不强，目的基因表达水平低，容易引起免疫耐受.

鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗，在试验阶段已表现出具有良好的免疫效果.2001～2002丁壮等将NDV HN基因亚单位疫苗免疫试验鸡后，用NDV强毒攻击，保护率≥65%；王兴龙等用 Bac-to-Bac表达系统，在昆虫细胞中表达了NDV F蛋白，诱导机体产生了较高滴度的抗 NDV F蛋白抗体；2003秦智锋用重组菌pGHN/DE3生产的亚单位苗，也激发了免疫鸡较高滴度的抗体.Mori等用昆虫杆状病毒作载体表达ND D26株的F基因，表达的F蛋白分泌到了细胞膜，其制备的亚单位苗，能抵抗NDV强毒的攻击，但因成本高，难用于生产.2000年李广要等用天然磷脂脂质体包裹NDV HN基因的真核表达质粒peIJNM，免疫幼龄雏鸡，7天后特异性抗体开始升高，免疫后6周用致死剂量的F48E9攻击，免疫组存活率90%.2001～2003年我国多位学者进行的NDV HN基因核酸疫苗的构建和免疫保护性试验，皆取得了一定效果[21-23].2006年孟凡臣已成功将NDV F抗原基因，介导转化导入马铃薯叶片和茎段，获得12株ND转基因植物疫苗.有学者认为转基因植物疫苗是未来疫苗的发展方向之一[24].

4 新城疫检测方法

4.1 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验

HA和HI是NDV检测、抗体监测最常用的血清学方法，用于监测疫苗接种效力或检测鸡群感染鸡新城疫的程度，特异性好、样本用量少、操作简单、成本低廉，用LaSota株制成浓缩抗原的HA和HI试验，效果令人满意，常用以定性或定量NDV及其抗体滴度，但分离的NDV仍需测定MDT、ICPI和 IVPI确定毒力，或采用RT-PCR扩增F基因结合测序确定分离株的毒力.

4.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

国内、外学者建立的ELISA的间接法、双抗体夹心法、捕获法、竞争法等试验方法相对于HA和HI试验，具有很高的敏感性，能定性及半微量、微量、超微量定量分析，样本用量少、快速、通量高，但影响ELISA的因素较多，如反应温度和时间.

4.3 分子生物学技术

荧光定量RT-PCR（Real time RT-PCR）和环介导等温核酸扩增技术（LAMP）在一个反应管中完成反转录和PCR过程，实时监测整个PCR进程或定量分析，直观快速地观察结果.基因芯片技术在普通 PCR基础上，将核酸信息按要求固定在特定载体上制成基因芯片，进行生物组信息平行性分析和检测，从基因水平检测NDV病毒核酸，特异、敏感、高通量.1992年Jarecki-Black设计的与NDV F基因5′端非编码区互补的核苷酸探针，该探针能将弱毒株与强毒株和中毒株加以区分，应用价值极高[25].但该方法易污染，仪器设备价格昂贵，对环境及操作人员的技术水平要求较高.

5 展望

新城疫的免疫防控取得了一定的成效，但多种病原的混合或/和继发感染，鸡群的免疫抑制问题等，要求养殖者除关注新城疫强毒或野毒感染外，对频繁使用的活疫苗也要有足够的认识，高频率、大剂量NDV活疫苗在机体中感染复制产生免疫应答的同时，也可对鸡呼吸道上皮细胞产生损害，如果与其他病原产生协同作用，则有可能促进NDV疫苗病毒的大量增殖，造成严重的疫苗免疫反应.只有确定合理的免疫程序，运用高效安全的疫苗，监测新城疫抗体水平，才能有效防控鸡新城疫.