分光光度仪在测量苹果酸含量方面的应用

赵鹤然，安家彦

（大连工业大学生物工程学院，辽宁盘锦 124010）

0 引言

苹果酸是影响葡萄酒品质风味的重要指标，是葡萄酒发酵过程中的重要中间产物之一，苹果酸—乳酸发酵是影响葡萄酒风味的重要反应，葡萄酒的酿造过程中需要人为地加强或抑制苹果酸乳酸发酵以达到预期风味[1-3]。所以，葡萄酒中苹果酸含量的测定一直是一项重要课题。通常测量葡萄酒中苹果酸的方法有酶法[4]、毛细管电泳法[5]、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[6-9]。其中最常用的方法是采用HPLC法。近年来，葡萄酒的需求日益增长，出现了大量小型酒庄与酒厂，由于HPLC法的仪器昂贵，所以在应用上存在诸多限制。

传统的分光光度法[10]无法测量葡萄酒中的苹果酸含量，因为葡萄酒中含有大量有机酸与有机物，对测量结果影响较大。本实验建立了一种新的分光光度法对葡萄酒中苹果酸含量进行测量，并检测该法的稳定性与精密性，通过对比实验，判断该法是否可作为HPLC法的一种成本低廉的替代方法。

1 实验材料与仪器

本实验所用仪器有数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）、高速离心机（北京医用离心机厂）、电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、分光光度计（上海精科有限公司）、电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、附温比重瓶（淄博市现代科学器材有限公司）等。

2 实验方法与结果

2.1 分光光度法测定苹果酸的含量

2.1.1 对照品的制备

精密称苹果酸对照品0.01 g至100 mL容量瓶中，加纯净水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

2.1.2 供试品的制备

取1 mL葡萄酒发酵液样品至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至10 mL，摇匀，10 000 r/min离心15 min后（4 ℃），0.22 μm的针式滤器过滤。

2.1.3 分光光度法测定苹果酸含量的原理及方法

苹果酸和乳酸能和浓硫酸在水浴条件下经显色剂2，7-萘二酚发生显色反应，这些显色物质在390 nm处有最大的吸光值。通过构建苹果酸—乳酸关系标准曲线的回归方程，在乳酸含量已知的条件下（乳酸含量采用可见分光光度法测量），计算可得样品中苹果酸的含量。

2.1.4 吸收度与苹果酸—乳酸浓度的关系

配置10 mg/L的苹果酸标准溶液和10 mg/L乳酸标准溶液：取 25 支 5 mL 离心管，移取 0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL的苹果酸各5组，每组分别加入乳酸0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL复配，再用蒸馏水补至2 mL；然后在各离心管中分别加入100 mg的氢氧化钙粉末，混匀，8000 r/min离心5 min；吸取上清液1.5 mL，加入预先加有20 mg氢氧化钙粉末的5 mL离心管中，混匀，再加0.1 mL的20%硫酸铜溶液，迅速混匀，沸水浴3 min；流水冷却，补足重量，再3000 r/min离心5 min，分别吸取上清液1.0 mL加入比色管中。每管各加入6.0 mL预冷的浓硫酸，再加0.1 mL的2，7-萘二酚显色剂，沸水浴20 min，放入冰水浴中冷却，用蒸馏水做空白对照，在波长390 nm处，分别测定其吸光值。得到苹果酸—乳酸关系的回归方程

其中，y苹为苹果酸含量，g/L；y乳为乳酸含量，g/L；x 为分光光度计测得的吸光值。式（1）的相关指数R2=0.9848。

2.1.5 可见分光光度法精密度试验

取1 mL的葡萄酒发酵液，经2.1.2处理后，制得苹果酸供试液，将供试液通过2.1.4方法处理后，通过分光光度法测定，重复上述操作6次。配置10 mg/L的苹果酸对照品，通过2.1.4方法处理后，通过分光光度法测定，重复上述操作6次。将测得结果代入式（1）计算苹果酸含量（表1）。

表1 分光光度法精密度试验结果

2.1.6 可见分光光度法稳定性试验

取 4 ℃下储存的供试品，分别在 0 h，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h利用分光光度法进行测定，记录其含量，苹果酸含量分别为17.13 mg/L，17.35 mg/L，18.32 mg/L，18.72 mg/L，18.93 mg/L，19.01 mg/L，平均含量18.24 mg/L，相对标准偏差为4.47%。

2.1.7 可见分光光度法加样回收试验

选用葡萄酒发酵液进行加样回收实验。发酵液样品经稀释后呈无色，对分光光度测定无颜色干扰，经2.1.4处理后，用分光光度法测定苹果酸含量，然后加入已知浓度的标准苹果酸测定（表2）。经计算，平均相对回收率为101.0%，相对标准偏差为1.53%。

表2 分光光度法加样回收试验结果（样品含量17.17 mg/L）

2.2 用HPLC法作对照测定葡萄酒发酵过程中苹果酸含量变化

2.2.1 色谱条件

Unitary C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相 KH2PO4（0.02 mol/L，pH=2.4）；检测波长210 nm；柱温30 ℃；流速0.8 mL/min。

2.2.2 HPLC线性关系

精密称取苹果酸对照品，取 10 mg，20 mg，40 mg，80 mg，160 mg，置于100 mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，摇匀。每次取10 μL，注入液相色谱仪，记录液相色谱图，供试品液相色谱分析如图1所示。并以峰面积为横坐标，以浓度（g/L）为纵坐标，进行回归分析，得回归曲线（图2）。

2.2.3 葡萄酒发酵过程中的有机酸含量

将葡萄酒酵母以5%接种量（体积分数）接入500 mL 19%的葡萄酒原液培养基中，在20℃条件下进行发酵，发酵周期为14 d。每24 h无菌操作移取发酵液用于分析，取样量为10 mL，经2.1.2处理后，分别进行HPLC和分光光度进行测定（图3）。

由图3可知，分光光度法测定苹果酸含量时，其数值略高于HPLC法测定值。这是由于，在发酵液的处理过程中存在微量残余蛋白质，蛋白质被硫酸碳化，加深了溶液颜色，使得数值偏高。但其趋势与HPLC法测定的苹果酸含量相同。由此可见，分光光度法可较为准确地测定葡萄酒中丙酮酸含量。

图1 苹果酸供试品

3 结论

（1） 本实验所用分光光度法可排除乳酸等因素的干扰测得苹果酸含量，可用于测量葡萄酒等有色物质中的苹果酸含量。

（2）分光光度法有良好的稳定性，精密度好，回收率高。

（3） 通过与常用的HPLC法作对比，分光光度法结果相对比较准确，可重复性也较高。

由于分光光度法的检测成本远低于HPLC法，所以应用面更广，可普遍应用于小型酒厂及酒庄。

图2 吸收度与浓度关系

图3 葡萄酒发酵过程中苹果酸的含量

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