瓦氏雅罗鱼杀鲑气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

李 博 何亚鹏 刘 宁

瓦氏雅罗鱼，又被称为华子鱼、白鱼，是鲤科、雅罗鱼亚科、雅罗鱼属的代表鱼类。瓦氏雅罗鱼最适宜的水质为弱碱性，水溶氧量应高于5 mg/L，透明度在30 cm左右。在这样的水域中，瓦氏雅罗鱼能保持较好的生长状态[1]。由于捕捞强度的增加、生态环境的变迁以及疫病的影响，瓦氏雅罗鱼的数量逐渐减少，瓦氏雅罗鱼作为北京土著鱼类，是北京市二级保护鱼类，其资源现状堪忧。

杀鲑气单胞菌是一种革兰氏阴性短杆菌，隶属于气单胞菌属气单胞菌科。该菌在全球范围内分布广泛，可引起鲑鱼科鱼类的“疖疮病”和“败血症”，典型临床症状为鱼体表面多处溃烂。近年来，研究发现杀鲑气单胞菌也可感染其他鱼类，如鲤科鱼类，该菌还可与其他细菌混合感染，对鲑鱼科和鲤科鱼类危害很大[2]。本试验从北京市水生野生动植物救护中心驯养车间患病的瓦氏雅罗鱼体内分离纯化出1株杀鲑气单胞菌，然后对其进行了理化特性、分子生物学特性及耐药性分析，并根据药敏试验结果选择用药，有效地对瓦氏雅罗鱼进行了救护。

1 材料与方法

1.1 材料 患病的瓦氏雅罗鱼来源于北京市水生野生动植物救护中心驯养车间。营养琼脂培养基、生化鉴定试剂和药敏纸片均购自北京赛为思生物技术开发中心，细菌DNA提取试剂盒（DP302）、2×Pfu PCR Master Mix（KP201）购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离 取患病的瓦氏雅罗鱼，在超净工作台内采集内脏，划线接种于营养琼脂培养基上，28 ℃细菌培养箱内培养20 h，观察形成的菌落的形态、颜色和大小等。将分离菌进行革兰染色，在显微镜下进行观察。

1.2.2 生理生化鉴定 将菌株分别在无菌条件下穿刺接种于细菌生化鉴定管中，根据《常见细菌系统鉴定手册》对该菌株进行系统的理化特性测定[3]。

1.2.3 16S rDNA基因的扩增 采用16S rDNA通用引物（上游16SF：5’-CTAAGCCAGGATCAAACTCT-3’；下游16SR：5’-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’）。 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌的DNA作为模板，按常规PCR方法进行扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带大小。阳性样品由华大基因公司测序。

1.2.4 药敏试验 采用K-B法对分离菌株的药物敏感性进行检测。将培养16 h的该分离菌菌液涂布在检测平板上，平板于室温中放置4 min等待干燥，在合适区域贴上药敏纸片，室温放置10 min后，倒置于28 ℃细菌培养箱内培养18 h，在黑色无反光的背景下测量包括纸片直径在内的抑菌圈直径，判定该菌的药物敏感性。

2 结果与分析

2.1 临床症状 患病的瓦氏雅罗鱼鳞片大面积脱落，身体表面存在多处出血，鳃盖和眼周出血，尾部有溃烂。

2.2 细菌形态 营养琼脂培养基上的菌落为圆形、不透明、表面光滑、隆起及边缘整齐，菌落为中等大小。染色镜检发现该菌为革兰氏阴性的短杆状细菌。

2.3 理化特性 由分离菌的生化鉴定结果可知，该菌株不具有动力性，枸橼酸盐、氧化酶、鸟氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、赖氨酸脱氢酶、尿素、蔗糖和VP试验均为阴性，半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、七叶苷和葡萄糖试验为阳性。根据《常见细菌系统鉴定手册》，将其初步判定为杀鲑气单胞菌。

2.4 16S rDNA的扩增结果及序列分析 以分离细菌的DNA为模板，用16S rDNA通用引物进行PCR扩增得到约1 500 bp的核酸片段（见图1）。将分离菌的测序结果用GenBank中的BLAST工具进行序列比对，结果表明该序列和杀鲑气单胞菌的杀鲑亚种代表株相似性在99%以上，表明该菌株为杀鲑气单胞菌。

图1 PCR扩增结果

2.5 药敏试验结果 药敏试验表明，该分离菌株对强力霉素、阿米卡星等抗生素敏感，对利福平、红霉素、环丙沙星、诺氟沙星等中度敏感，对青霉素、甲氧卞胺嘧啶、卡那霉素等药物耐受。

2.6 用药结果 根据上述药敏试验结果，选择强力霉素和阿米卡星拌料治疗，同时在池水中加入抗菌中草药，对发病的鱼池采用聚维酮碘消毒，短时间内有效地控制了该疫情。

3 讨论

杀鲑气单胞菌可引起鲑鱼科、鲤科等鱼类产生皮肤溃烂等症状，以至出现败血症、死亡，对鱼类养殖和鱼种保护造成严重的损失［4-5］。本试验中瓦氏雅罗鱼感染杀鲑气单胞菌的原因可能是鱼刚到新的水体环境中，由于应激和饲养模式变化等原因，导致鱼的抵抗力下降，从而感染该菌，导致疾病。动物养殖过程中常选用抗生素进行细菌性疾病的防治，但其选择和使用需要有科学性，长期不合理使用同种药可诱导病原菌产生耐药性，药物会失去作用，动物体内也会有大量药残。因此，在选择药物前需要做好药敏试验，合理慎重用药。本研究可为进一步研究杀鲑气单胞菌的防治奠定基础，为杀鲑气单胞菌感染的临床用药提供参考。

[1]孟和平，韩国苍，高玉奎，等．达里湖鲫鱼、瓦氏雅罗鱼资源的可持续发展[J]．当代畜禽养殖业，2015（10）：48．

[2]王海娟，王利．鲤鱼杀鲑气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析[J]．中国畜牧兽医，2015（1）：192-196．

[3]蔡妙英，东秀珠．常见细菌系统鉴定手册[M]．北京：科学出版社，2001：364-399．

[4]刘宁，时晓，杜迎春，等．患病细鳞鱼杀鲑气单胞菌的分离与鉴定[J]．淡水渔业，2015（1）：88-92．

[5]王家祯，耿昕颖，董文龙，等．3株杀鲑气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J]．中国兽医杂志，2017（2）：78-80．