HPLC法测定重楼块根中4种重楼皂苷含量研究

韩 平，阮成江，王海明，杜 维，丁 健，张莞晨

(大连民族大学 生物技术与资源利用教育部重点实验室 资源植物研究所，辽宁 大连 116605)

重楼(ParispolyphyllaSmith var.)为百合科植物，其根茎可入药，有清热解毒、消肿止痛、止血、凉肝定惊之功效，对治疗癌症、跌打损伤等有显著疗效[1-2]。重楼是云南白药、宫血宁等药的主要组成药物，其主要的有效成分为甾体类皂苷，存在于多种重楼属药材中，在生物学功能的研究中发现其有很强的生理和药理活性。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ为重楼药材中最主要甾体类皂苷生物活性成分，现有研究已表明其生理和药理活性明显，可大规模应用于各种药品制备[3-5]。目前，重楼药材中的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量已经成为了重楼药材质量控制的一个重要标准，建立其含量检测的有效方法具有非常重要的意义[6-8]。

本研究以中药材重楼为原料，优化建立了高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测超声乙醇法提取的重楼块根中主要有效活性成分重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ含量的方法，为开发重楼保健药品、食品等提供理论依据和参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

重楼购自辽宁省大连市开发区药店,4种重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，乙醇和乙腈溶液均为HPLC色谱纯，水为超纯水。高效液相色谱型号为Flexar FX-15(美国PE公司)，超声仪型号为SB-52000(宁波新艺超声设备有限公司)。

1.2 色谱条件

Validated C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)。梯度洗脱过程为：0～3 min，10%乙腈；3～38 min，60%乙腈；38～43 min，60%乙腈；43.1 min，10%乙腈；43.1～45.0 min，10%乙腈。流速为0.8 mL·min-1，检测波长为208 nm，进样量为10 μL，柱温为28 ℃。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的制备

(1)混合对照品溶液的制备

精确称取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的对照品，放置于10 mL容量瓶中，然后加入乙醇溶液定容，配制成质量浓度分别为重楼皂苷Ⅰ0.540 mg·mL-1，重楼皂苷Ⅱ0.434 mg·mL-1，重楼皂苷Ⅵ 0.126 mg·mL-1，重楼皂苷Ⅶ 0.103 mg·mL-1的混合对照品溶液，混匀，置于4 ℃冰箱保存待用。

(2)供试品溶液的制备

将烘干后的重楼块根制成粉末，精确称取该粉末5份，每份0.500 0 g，置于密封瓶中，精确量取乙醇溶液25 mL加入到瓶中，用电子天平称定其初始质量并记录，然后用超声仪(200 W，40 kHz) 超声提取40 min，冷却至室温后再次称其最终重量，用乙醇溶液补足失重，混匀后，过0.22 μm微孔有机滤膜得到供试品溶液，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 线性关系考察

精确量取混合对照品溶液0.1、0.25、0.5、0.75和1.0 mL，加入乙醇溶液定容至1 mL，混匀后注入高效液相色谱仪，根据上述色谱条件，对其进行检测分析并记录色谱峰的峰面积。以重楼皂苷的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，拟合回归方程和线性范围见表1。

表1 重楼中4种重楼皂苷的回归方程和线性范围

1.3.3 精密度试验

精确量取同一质量浓度的混合对照品溶液，根据上述色谱条件，对其进行HPLC测定分析，将该样品重复测定5次，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)。

1.3.4 重复性试验

分别精确量取5份供试品溶液，每份1 mL，根据上述色谱条件，对其进行HPLC测定分析，记录其色谱图的峰面积，带入回归方程记算出重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量。

1.3.5 稳定性试验

精确量取1份供试品溶液1 mL，分别在0、2、4、8、16、24和48 h时进行HPLC测定分析，记录色谱图的峰面积， 计算峰面积的RSD。

1.3.6加样回收率试验

精确量取5份供试品溶液，每份1 mL，分别精确加入混合对照品溶液(重楼皂苷Ⅰ1.024 0 mg·mL-1，重楼皂苷Ⅱ0.316 0 mg·mL-1，重楼皂苷Ⅵ 0.037 2 mg·mL-1和重楼皂苷Ⅶ0.070 6 mg·mL-1) 5 mL，配制得到供试品溶液，根据1.2色谱条件，对其进行HPLC测定分析，记录色谱图的峰面积。

2 结果与分析

精密度试验结果显示，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的峰面积RSD分别为1.87%、1.71%、1.90%和1.25%(n=5)，RSD值均小于2%，表明仪器的精密度良好。

重复性试验结果得到它们的平均含量分别为22.65、6.825、0.803 0和0.882 0 mg·g-1，所对应的RSD分别为1.37%、1.29%、1.91%和1.02%，RSD值均小于3%，结果表明该方法的重复性良好。

稳定性试验结果显示，峰面积的RSD分别为1.48%、1.86%、1.37%和2.05%(n=5)，RSD值均小于2%，表明重楼样品的供试品溶液在48 h内的稳定性良好。

加样回收率试验结果显示，重楼皂苷Ⅰ的平均回收率为99.12%，RSD为1.95%；重楼皂苷Ⅱ的平均回收率99.10%，RSD为1.89%；重楼皂苷Ⅵ的平均回收率99.46%，RSD为2.01%；重楼皂苷Ⅶ的平均回收率为96.52%，RSD为2.25%，表明方法的准确度良好。

精确量取供试品溶液3份，每份1 mL，依据1.2色谱条件进行测定，色谱图如图1。记录色谱图的峰面积，代入回归方程计算出样品中不同重楼皂苷的含量。结果得到，重楼皂苷Ⅰ含量的平均值为22.50 mg·g-1，重楼皂苷Ⅱ含量的平均值为6.915 mg·g-1，重楼皂苷Ⅵ含量的平均值为0.778 0 mg·g-1，重楼皂苷Ⅶ含量的平均值为0.876 0 mg·g-1。

注:1.重楼皂苷Ⅶ;2.重楼皂苷Ⅵ;3.重楼皂苷Ⅱ; 4.重楼皂苷Ⅰ

3 结 论

HPLC法具有较高的检测灵敏度，在检测分析中药材活性成分时可提供准确可靠的结果，且操作简便。本研究建立了利用HPLC法测定中药材重楼块根中4种重楼皂苷含量的方法，可为中药材重楼块根中的4种皂苷含量的定性定量分析提供科学方法，在中药材重楼的药用成分分析和开发利用方面具有重要意义。

本研究通过改进优化付绍智等[7]研究中HPLC检测的色谱条件70 min，20%～100%乙腈梯度洗脱，结果显示4种重楼皂苷在色谱柱中分离效果更佳。采用超声乙醇提取方法，利用HPLC测定的重楼块根中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量与罗延顺等[8]采用加热回流乙醇提取方法测定的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ含量(26.54、6.658、1.303和1.256 mg·g-1)的研究结果相差不大，但考虑到实验的操作过程，超声法的操作更简便。因而，超声乙醇提取法是HPLC测定重楼块根中4种主要重楼皂苷含量的有效方法。

[1] 刘佳,张鹏,宋发军, 等.重楼地上部分四种重楼皂苷含量的分析[J].时珍国医国药, 2015,13(5):1233-1235.

[2] 童立雷. 重楼总皂苷提取工艺及抗氧化特性[D].安徽:安徽农业大学, 2012.

[3] 汤海峰, 赵越平. 重楼属植物研究概况[J]. 中草药， 1998,29(12): 839-841.

[4] 王永慧,杨光义,叶方, 等.HPLC法测定重楼药材中重楼皂苷I和重楼皂苷II的含量[J].中国药师, 2012, 15(11): 1596-1597.

[5] 王丽峰.高效液相色谱法在中草药质量控制中的应用[D].重庆:西南大学, 2009.

[6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典一部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010：260.

[7] 付绍智, 李楠, 刘振, 等. HPLC法测定不同产地重楼属植物中7种甾体皂苷成分[J]. 中草药, 2012, 36(12):2435-2437.

[8] 罗延顺,胡建勇,李杨, 等.HPLC法测定重楼种植药材中4种重楼皂苷的含量.中国药师, 2016, 19(1): 5-7.