浅谈“5M1E”分析法在NGS实验室管理中的应用

潘石玄伟

（杭州联川生物技术股份有限公司，浙江 杭州 310018）

随着高通量测序技术为代表的现代分子生物学技术的突飞猛进，正在对传统的医学检验产生影响，高通量测序技术已在无创产前筛查、染色体拷贝数变异筛查、遗传病致病位点筛查、胚胎植入前诊断等临床检验中心应用。最近随着国家食品药品监督管理局连续批准基于高通量测序技术（NGS）以及伴随诊断标准审批的多基因肿瘤突变联合检测试剂盒，高通量测序技术将会拓展到肿瘤领域精准医疗。

高通量测序技术不管是采用一站式的解决方案还是共建实验室的形式，只有检测结果质量的可靠，临床应用才能落到实处。如何保证检测结果的准确性？NGS实验室管理迫切需要科学化、规范化、标准化及国际化，那么“5M1E”分析法如何在NGS实验室管理中得以运用呢？

5M1E其实就是对全面质量管理理论中六个影响产品质量的主要因素的简称，是指6种分析维度与方法，其中五项的英文是以M开头，一项是 E 开头的，分别为：5M：Man（人），Machine（机），Material（料），Method（法），Measure（测）；1E：Environment（环）。

1 Man（人）

人员是NGS实验室管理中最活跃的因素，对实验室的全部活动起着主导和支配作用，是决定实验室检测质量的根本因素。

1.1 专业与能力

二代测序实验操作的复杂，对NGS检验人员不能仅仅停留在简单进行仪器操作这个层面上。为保证检验结果的快速、准确，不但要熟练掌握各种仪器的操作，更要了解可能影响检验结果的全方位因素，检验人员在技能方面必须有分子生物的专业知识和技术能力。

1.2 教育与培训

人员的培训在保证检验质量中尤为重要，从事二代测序的检验人员在上岗前必须先进行临检中心《临床基因扩增实验室技术人员培训合格证》和NGS技术的理论与技能培训。分析人员需要经过生物信息学的培训。

1.3 专才到全才

为了让检验人员可以保证质量的前提下快速上岗，可以将NGS实验室岗位细分，如收样、提取、建库、质检纯化、上机测序等，先按单岗进行培训考核上岗，定岗定区域，等熟练后再进行全方位培训，这样有助于实验室人员的安排，也有助于检测结果的准确性。

2 Machine（机）

机是指直接或间接用于检测分析的对检测结果有影响的仪器设备及有关辅助性仪器设备等，这里包含了测序后数据分析软件。

2.1 仪器设备的校准与确认

对于检测设备，经过采购、到货验收、安装调试等过程后，首先在设备投入使用前进行校准或验证确认，确保用于检测的设备及其软件达到检测的准确度和规范性。当校准报告给出一组修正因子时，需要将其校准因子在实际中得以正确运用，否则会有仪器偏差引入。

2.2 数据分析软件

这是NGS实验室特有的环节，实验室需要用商品试剂配套的软件进行数据分析，确认使用软件的版本和数据库的现行有效版本；数据需要专业的生物信息学人员进行分析，需要在数据预处理、数据比对、数据质控、分析判断等每个流程进行质控，确保数据分析的准确性。

2.3 仪器的配套使用

需要使用商品试剂申报时的配套仪器的型号，如广州燃石医学检验所有限公司人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒 （可逆末端终止测序法）受理号为CSZ1700157，配套的型号为Illumin公司生产MiSeqDx，虽然Illumina公司有 MiSeq、MiniSeq、NextSeq500 等不同型号的测序仪，而在检测过程中必须采用MiSeqDx型号的仪器，否则会带来仪器之间的差异，影响检测结果的准确性。

2.4 设备的标识

设备标识是设备管理过程中非常重要的一个环节，设备要有一个唯一性编号的标识，这个编号是唯一性的，虽然是同样型号的也不允许重复，只有这样才能做到检测数据的溯源性要求。还有设备的运行、维修、暂停等状态，防止设备的非预期使用影响到检测结果。

2.5 设备的维护和保养

设备要定期做好维护和保养，一般校准和验证的周期为1年，中间可以采用标准物质或同型号设备间进行比对，确保设备的性能，保证结果的准确性。如设备有大的关键零件的维修更换、精密仪器的搬动位置等，需要对设备的性能重新进行验证确认。如测序仪等设备对外界环境有温湿度要求的，要确保环境要求符合要求并做好监控好记录，否则外界环境对检测结果都存在影响。

3 Material（料）

不局限于实验室的试剂和耗材，还包含检测的样本，检测记录和报告。

3.1 样本

确保NGS检测结果的准确性，样本的质量起着关键性的决定作用，实验室应制定正确采集处理原始样品、标识及样品的质检标准的文件化程序。

3.1.1 采集前活动的指导

如采集的方法、影响采集方法的因素，样本采集的类型和量、样本存储的容器和必需添加物。

3.1.2 采集活动的指导

采集患者身份的确认、采集样本的原始标识，采集时间等。

3.1.3 样品的存储和标识

样品存储温度的要求、使用的保存液，从样本开始直到样品报告出具的在整个实验室流转过程都具有唯一性标识，防止混淆。除了样本本身的区别标识，还应该有样品的状态标识，如待检、检测中、已检三种状态，分别存放在不同的区域中，做到有效隔离。

3.1.4 制定样本的质检标准

如石蜡包埋 （FFPE）的非小细胞肺癌（NSCLC）组织样本，肿瘤细胞含量应达20%以上，提取的DNA量应大于50 ng才能开始NGS的下一步检测，如样本质检不合格需要重新进行采样，如不进行样本的质检直接进入下一道工序，到最后发现检测结果不符合要求，耽误患者用药时间。

3.2 试剂

实验室应制定用于试剂的接收、验收、使用、存储的文件。试剂到货时进行外观及性能的进货验收，按照存储温度及批号规则进行试剂的存放，按照批号、效期的原则录入到系统并做好库位卡，试剂领用做到先进先出原则。商品化试剂在用于临床样本检测应进行有效的性能验证（如准确性、灵敏度、特异性）。NGS的商品试剂因都是低温保存，一般都会有开瓶有限期和反复冻融次数要求，实验室在使用过程中需要及时记录开瓶日期和冻融次数，使用时可根据需要进行分装，避免反复冻融。若分装后的物料需要继续保存，则应注明物料名称、原瓶开瓶日期、分装日期等信息，确保试剂的可靠性。

3.3 耗材

NGS实验室都会用到各种规格的移液枪头、PCR管、离心管等一次性耗材。市场上有众多的厂家及规格型号，在NGS实验过程中应确保使用无菌、滤芯、低吸附的规格型号；同时确保无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

3.4 记录和报告

记录和报告也是一种特殊的物料，记录设计要有检测样本、使用的设备编号、使用的试剂批号、检测日期、检测人、复核人、检测结果的原始数据等信息，方便追溯。每个实验环节需要及时、准确、真实填写各种记录，定期整理归档管理。检测报告内容应包括但不局限于患者人员信息、病历信息、样本信息、所用试剂和分析软件信息、检测结果及解释，报告人及有签发报告资质人员的签名。报告应简洁扼要、通俗易懂。

4 Method（法）

为了使NGS实验规范管理，操作标准统一，保证检测结果的准确性！需要制定各种程序性文件、作业指导书、记录表单，文件保持现行有效版本，方便实验室人员随时取阅，做到“有法可依、有法必依、执法必严、违法必究”。

4.1 程序性文件

可以参照CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》的要素建立实验室管理的质量手册和程序性文件。

4.2 操作性规程

可以采用图文并茂的方式建立实验操作细节、设备操作规程、质控方法及质控标准等。

4.3 记录表单

可以根据NGS的工序如收样、提取、建库、纯化、上机测序各工序形成全套的实验操作记录；另外配套的各类表单如设备使用、维护、保养记录、温湿度监控记录、试剂的配置记录等，均需实验室受控发放使用。

5 Environment（环）

“环”是指检测过程中的实验室硬件环境。

5.1 实验室设计布局

NGS实验室设置应该严格分区，申请临床基因扩增检验实验室验收，标准化分区及空气流向，确保工作有序，互不干扰，防止污染。原则上NGS实验室应当分为试剂储存和准备区、样本制备区、文库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域（第一扩增区）、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测区、测序区、电泳区共八个区，每个房间压差依次梯度≥5 Pa，设置PCR专用走廊和缓冲间，在缓冲间内，可设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。

5.2 人流物流管理

严格人流物流分开，严格遵守从一区到八区的单一方向制度，不得反向进入前一个区，尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染。

5.3 区域管理

在各个实验区使用带有明显区别标志的工作服和物品（如不同颜色），每个工作区域均有专用的仪器设备，各区域仪器设备须有明确的标记，避免设备物品如加样器等从其各自的区域内移出，当工作人员离开时不得不将本区的工作服、手套、口罩和物品带到其他区域，从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆污染。

5.4 环境卫生

每个区域都应该有独立的清洁工具，每个区域的清洁工具不得混用，清洁时候从一区到八区的单一方向制度，工作结束后用75%的乙醇擦拭工作台面，用紫外线灯（建议安装无臭紫外灯）进行照射，要注意实验室的通风换气。

6 Measure（测）

“测”是指为了提高检测结果准确性和可靠性所采取的有关措施和活动。

6.1 实验室间质评（EQA）

也叫室间质量评价，是国家卫健委利用各实验室间的比对来确定实验室能力的活动，实际上它是指为确保实验室维持较高的检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动。这是NGS实验室证明自己能力的一种很好手段，也使自己实验室技术能力走出行业的一个窗口，应该积极报名参加。

6.2 实验室间比对

实验室间比对是按照预先规定的条件，由两个或多个实验室对相同或类似的测试样品进行检测的组织、实施和评价，从而确定实验室能力、识别实验室存在的问题与实验室间的差异，是判断和监控实验室能力的有效手段之一。

6.3 人员比对

为了提高自己实验室人员的技能，建议定期开展人员比对，这是维持和提高检验人员能力水平的一种很好的手段。倡导实验室形成你追我赶的氛围，不断提升实验人员的技能。

6.4 盲样测试

能直接反映实验室的仪器设备和技术水平，可以作为实验室技术人员转正考核的一种手段。

6.5 阳性对照和阴性对照

每次检测都必须放置阳性对照和阴性对照，作为最终判断结果的参依据。阴性质控品（NC）的检测结果应为阴性，若其中有突变检出，说明环境中可能存在DNA污染源。阳性质控品（PC）的检测结果应为某个基因突变对应阳性，如果突变未检出，说明试剂盒性能不理想或操作过程有误，此次检测结果无效。

7 结语

随着精准医疗的发展，NGS检测有助于疾病的诊断分类，可以加深人们对疾病的认识，指导疾病的靶向治疗，但是NGS检测的质量控制仍然存在问题：实验室设计、实验室人员水平、质量保证手段等。我们只有有效运用“5M1E”分析法，规范NGS实验室管理，保证质量，向临床提供真实、客观、准确的检测结果，才能更好的为大众健康服务。