提高关节软骨脱细胞支架孔隙率及细胞渗透性方法的研究进展

赵忠琪 王晓坤 彭慧敏 梁家迪 王小晋 刘 畅*

1(吉林大学口腔医学院，长春 130021) 2(广州医科大学附属口腔医院，广州 510140)

引言

软骨组织是一种具有弹性的抗压特殊结缔组织，在体内主要起到保护和支持的作用。软骨组织内无神经、血管，细胞成分少，且组织较为致密，代谢活性低，因此软骨组织修复再生能力差，损伤后常由软骨膜形成的纤维结缔组织替代修复。临床上常见的由骨关节炎或外伤导致的关节软骨缺损常表现为水肿、关节疼痛和功能障碍，未经有效处理还可能引起进一步的组织降解，最终需要进行整体的关节置换。[1]目前，临床上常用的修复关节软骨缺损的外科治疗手段包括：自体软骨细胞移植、微骨折术、软骨组织移植术、同种异体移植等。这些治疗方法均存在不同程度的限制，例如:供体来源不足，免疫排斥反应，生成的软骨与天然组织的结构、成分、机械强度差距较大，远期效果不佳等[1-2]。

组织工程的出现和发展使得关节软骨的生物学替代物即人工构建软骨成为可能。生物支架材料是构建人工软骨的中心内容之一，也是软骨组织工程领域研究的热点。常用的支架材料按其来源可分为天然生物材料、人工合成高分子材料和复合材料[4-5]。其中天然生物衍生材料来源于生物组织，与人工聚合材料相比，具有更好的生物相容性和生物识别优势，因而成为组织工程研究热点。

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是一种特殊的天然生物衍生材料，主要通过理化方法去除组织或器官中的细胞及抗原成分所获得。它是组织或器官脱细胞后剩余的结构和功能蛋白的复合体，对于细胞黏着，细胞分化和细胞与生物材料之间的连接有着重要的作用[6]。近年来的研究表明，ECM能够为细胞的生长提供组织特异性的微环境，并作为支撑细胞生长的三维支架结构，提供化学信号和生物力学的信号，诱导和调控细胞的黏附、生长、增殖和分化，促进组织修复与再生而无须降解和去除[7-8]。

软骨脱细胞基质由于其特殊的制备方法及组织结构特异性，相较于其他材料的孔隙率更低，调节手段也较为有限，加之软骨组织的致密结构，因此支架的细胞渗透性能成为软骨脱细胞基质材料发展中的难点。孔隙率与细胞渗透性是支架材料的重要评价指标，良好的孔隙率可以为细胞提供向深层增殖、迁移的途径，促进细胞间的交流与相互作用，并提供营养物质和代谢产物的运输通路，维持细胞正常生存环境，保证组织工程移植物的成活。研究显示，对各种生物工程支架材料(如人工聚合材料、天然生物衍材料)，可以通过改变支架的微观结构或成分配比等多种方法来调节孔隙率及孔径[9-12]。相较而言，软骨组织的调控方法则具有其特殊性。因此，本研究通过大量的文献检索，总结了目前针对调控软骨脱细胞基质支架孔隙率的实验方法，对支架性能与调控方法之间的关系进行综述。

1 软骨细胞外基质与脱细胞

软骨细胞外基质作为一种生物材料，其组织成份和结构对种子细胞的生物学行为起着至关重要的作用。ECM的成分主要包括水、蛋白质(胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、整合素等)、糖胺聚糖(GAGs)，以及生长因子和细胞因子。在软骨基质中，胶原蛋白占干重的95%，在组织中按照一定规律紧密排列，构成微观的纤维网络结构并承担负荷。ECM的另一种主要成分是蛋白多糖(proteoglycans)，由GAGs装饰核心蛋白构成，具有促进细胞黏附、保持结缔组织水分、调节物质交换，增强组织抗压性能等重要作用[47]。

然而，由于软骨ECM 的致密组织结构不能满足种子细胞生长需求，且脱细胞(decellularization)过程中的化学试剂通常会导致ECM中蛋白多糖含量的降低。因此，有研究者在常规理化方法脱细胞的基础上，对组织应用软骨素酶等酶制剂处理，彻底清除组织中的蛋白多糖，只保留构成纤维网络骨架结构的胶原蛋白，以期望能够获得更高的孔隙率和细胞渗透性[15，48]。 这种方法在软骨组织中的作用效果尚不明确，虽然能够达到满意的清除效果，但所提供的孔隙率仍然较低，因此需要进一步地研究与方案优化。

由于酶法消化所提供的孔隙率十分有限，且蛋白多糖具有重要的生物化学和生物力学性能，因此将软骨组织制备成软骨颗粒成为了一种被广泛应用的方法。目前大多数研究在脱细胞处理前，要通过研磨或冷冻研磨的方法制取软骨颗粒，这样可以增大组织与试剂的接触面积，降低脱细胞处理的难度，更容易获得良好的脱细胞效果[11-14，17-18]。脱细胞处理后的软骨颗粒经过冻干成型技术，可以获得具有相对较高孔隙率的支架。通过这种方法获得的支架不影响其支持细胞附着和软骨方向分化的特性，但牺牲了材料的机械性能，并且不能保持原有的天然组织的胶原结构[15]。因此，仍然有许多研究者针对不粉碎的软骨组织进行直接脱细胞处理，同时采取其他额外的手段增加支架孔隙率，促进细胞渗透。

2 浓度调控

在颗粒状软骨基质冻干成型的过程中，支架的孔径及孔隙率与细胞外基质的浓度成反比，较低的浓度更利于广泛地形成形状不规则且互相连通的孔隙。同时，支架的机械强度则随浓度的减小而降低。接种细胞后，低浓度支架相较于高浓度支架有更为明显的细胞渗透。[12，16-18]研究显示，不同浓度支架经过细胞培养后，其机械性能的变化趋势具有较大的差异。一般情况下，由于存在酶的消化作用，经过培养后的支架其机械性能会发生明显的降低，但低浓度支架的压缩模量则有可能增高。这可能是由于低浓度(7%)的支架在未经过交联的情况下难以抵抗细胞介导的收缩而使原本疏松的结构被压实[16]。然而，Almeida等则提出了不同的结论——由于低浓度的支架细胞渗透水平较高，支架内沉积的GAGs含量多，因此低浓度(250 mg/mL)支架经过培养后的刚度会明显高于高浓度(500 mg/mL、1 000 mg/mL)支架[18]。由此可见，材料或移植物的机械性能是由ECM浓度、孔隙结构、以及细胞渗透程度共同决定的。

另外，与上述结论相反，Moradi等的实验表明，ECM的浓度与支架的孔隙率及孔径之间没有明显的线性关系[19]。这可能是由于不同实验所采用的软骨基质颗粒大小差别较大，并且不同实验采用的交联方式以及设定的浓度梯度也均有不同，这些均可能导致软骨基质的浓度与孔隙率之间的线性关系发生变异[16，19，27]。因此，通过改变浓度调节支架孔隙率与细胞渗透时还需要考虑多种因素的共同影响，各种因素之间的相互关系有待于进一步的实验研究证实。

浓度对细胞渗透性能的调控是非常有限的，接种后，绝大多数细胞仍局限地沉积于支架表面[20]。 因此，有更多的研究者致力于直接改变支架的微观结构，为细胞渗透进入支架的中间区域提供更为直接的通道。

3 单向冷冻

冻干(freeze drying)技术在构建组织工程支架中的应用十分广泛。在软骨组织工程中，ECM微粒悬液经过冻干后，可以获得具有多孔结构的固相支架。以水为液相的悬液经过低温处理发生冷凝过程，其内部的晶核形成并生长，将固相物质推开并局限于晶体结构之间，而后，通过升华将晶体去除，余留下来的固相物质即可构成具有微孔结构的支架。在这一过程中，结晶过程直接决定了获得的固态支架的结构[21]。冷凝过程中的成核作用是一个至关重要的步骤，它发生的位置和时间与形成的支架结构直接相关[22]。成核是一个随机的过程，它可以在整个样本体积中广泛发生，也可以通过诱导而使其发生于样本的特定区域，从而形成具有各向异性的晶体结构[23]。因此，通过调节冷冻过程中的各种参数，可以影响成核与结晶的过程，从而调控支架孔隙的尺寸、分布，并构建线性排列、甚至轮状排列的取向性孔结构[24-26]。

制备具有取向性结构的支架一方面可以为再植细胞提供直接有效的渗透途径；另一方面，也能够在一定程度上模拟天然软骨组织所具有的取向性微观结构，弥补经过研磨或匀浆后的软骨基质在构建支架时的结构与机械性能的丧失[15]。随着组织工程技术的发展，通过单向冷冻(unidirectional freezing)的方法构建具有线性孔隙结构支架，已是一项较为成熟的技术[28-29]。它是指通过在悬液中构建温度梯度，使液体分子沿温度梯度而排列成具有方向性的结晶。这种方法基于控制溶液在预冻过程中冰晶的生长方向这样一个简单的技术而完成，制备过程简单，不需加入额外的化学物质，避免了对支架的生物相容性产生影响[27]。

在将单向冷冻技术应用于软骨脱细胞基质的实验研究中，构建温度梯度的方法有多种，其不同的参数设置也直接影响了获得支架的结构。在一些研究中，样品被置于厚壁的圆柱体模具中，上端敞开与室温平衡，下端利用低温金属板，形成由上至下逐渐降温的一维温度梯度场[21]。这种方法形成的支架孔隙能够形成定向排列的通道，然而其孔径与孔隙率与非定向结构支架无明显差异。Rowland[16]等则采用了非金属材料，在两种材料——聚甲醛树脂模具与硅胶盖之间形成温度梯度，硅胶的(9 mm)厚度薄于聚甲醛树脂(25 mm)，加之两种材料本身性质也有差异，使得两种材料在低温环境下的冷却速率不同，从而形成温度梯度，使成核作用首先开始于硅胶的内表面。与前述结果不同的是，这种方法所形成的孔径与孔隙率均大于其对照组的非定向均匀支架。这种差异可能来自于模具冷冻速率的不同，绝缘材料与金属材料相比热传导速率更为缓慢，较易形成更大的孔隙[30-32]。除模具的自身性质外，模具的表面形态也可以影响支架结构。Rowland 等对模具表面进行了刻画，在硅胶内表面(成核部位)刻画出间距为90 mm，宽度为50 mm的嵴状突起-凹状沟槽结构，这种具有方向性的图案可以诱导晶核形成时沿沟槽结构排列，使软骨基质形成垂直于模具表面(成核表面)的层状结构，使支架形成二维的定向结构。同时，表面刻画还可以避免在单向冷冻过程中成核表面形成一部分无线性孔隙排列的致密区[16，21]。

细胞的渗透性能是由支架的孔径大小决定的，然而，大量实验研究表明，定向排列的孔隙可以促进细胞的渗透[33]，这使得在一定的情况下，即使定向孔结构的孔径小于均匀孔结构时，仍可以表现出较好的细胞渗透性能[16]。植入细胞后，定向支架的孔结构具有更好的连通性，细胞更容易向深层增殖和迁移，并表现出了沿着线性孔隙分布与分泌基质的特性。具有足够孔径尺寸的定向孔支架与非定向孔支架，经过较长时间的细胞培养，均能表现出较均匀的细胞分布，然而这依然不能否定定向结构中的细胞早期快速黏附的重要性。在体内实验中，将再生软骨移植于骨软骨缺损处，支架的定向孔结构能够促进来自软骨下骨的软骨祖细胞的早期黏附，有助于移植物在关节部位的严苛的机械环境下保持稳固[16]。

在大部分实验研究中，定向孔结构能够增强支架的机械性能，在其取向方向上的压缩与拉伸模量均高于均匀孔结构支架[27，33-34]。然而通过刻画成核表面而形成的具有层状结构支架，机械性能会相对减弱[16]，而减小层状支架中的层间距离，可以使支架的压缩模量成倍增加[35]。因此，在层状结构的支架中，控制孔隙的尺寸对支架的机械性能起着至关重要的作用。有实验表明，经过较长时间的细胞培养后，软骨基质大量沉积形成新生软骨。此时，定向结构支架在机械性能方面存在明显优势，且移植物的机械性能呈现出随着培养时间的延长而增高的趋势[11，36]。然而，由于此时与机械性能相关的影响因素较多，例如，细胞的种类与密度，细胞的渗透程度，支架材料本身的强度，支架材料的浓度和交联方式，以及细胞与支架材料的之间的相互作用等，因此通过支架结构调控新生软骨机械性能的方式、以及结构因素与其他因素之间的关系还有待于进一步的研究探讨。

4 孔道

在组织工程支架中制造孔道结构，是一种人为构建细胞扩散路径的方法。在软骨基质支架中用针头直接穿刺形成孔道(channels)，可以简单便捷地改变支架的宏观物理结构，不仅可以应用于冻干法获得的支架中，在不经过研磨或匀浆的脱细胞软骨组织中也可以形成一定的细胞渗透路径。孔道结构对脱细胞的效果、支架的成分、微观结构均没有明显影响。另外，孔道结构的引入在增加支架孔隙率的同时不会影响支架的压缩模量。[15]

片状软骨脱细胞支架中的孔道结构能够促进细胞沿着孔道向支架内部发生明显的迁移，细胞分泌的基质也同时沉积在支架表面与孔道内部。值得注意的是，这种孔道结构的直径较宽，在支架中的孔道底部可见部分细胞死亡，这可能是由于孔道内大量的细胞聚集沉积，营养运输不畅所致。针对这一现象，可以通过生物反应器进行动态培养，增强营养物质与代谢产物在孔道内的运输，并为细胞提供了一定的生物物理刺激。这种培养方式明显提高了孔道内的细胞存活率，使细胞在孔道内均匀分布，并且增强了细胞分泌胞外基质的能力。然而与静态培养相比，旋转培养的细胞增殖程度有所降低，这种现象的原因可能来自旋转培养对细胞产生的剪切力影响了细胞黏附[15]。

5 激光微刻

孔道结构可以促进细胞向支架内部分布，但仍不能使细胞均匀地分布于ECM内。因此，为了提高细胞渗透性，完善支架性能，激光微刻技术(laser micropatterning, LMP)被引入软骨脱细胞基质，构建更均匀的支架微观孔道结构。

激光微刻是通过激光消融技术改变材料的物理结构以及表面性能的方法。激光照射生物组织时,对组织加热并产生热损伤，同时还可能发生组织汽化、熔融、喷射和高温分解等现象，这些现象导致生物组织被去除作用，称为“组织消融”(tissue ablation)[38]。CO2激光是一种普遍被用于消融生物材料的激光，波长是10.64 μm，其最小波束宽度为80 μm,这决定了其所形成的孔道直径落在了细胞黏附与增殖的最适直径范围内[39-40]。另外，根据需要形成的孔道直径还可以通过激光参数进行调节[41-42]。软骨基质经过激光消融前首先进行冻干处理，可以优化激光微刻的效果，避免组织内的水分使激光发生衍射。

激光微刻形成的孔道密度、直径、连通性是确定可控的，因此，对支架机械性能、细胞渗透，以及细胞的增殖分化与代谢活性的影响也一定程度可控。经过脱细胞处理的生物支架机械性能会发生明显下降[15]，而经过脱细胞、冻干、激光微刻、再水化的一系列处理后，所获得的生物支架与天然软骨之间有相似的机械压力-应变曲线，表明其具有与天然软骨相似的机械性能，其中，一定密度的激光微刻孔道结构对支架的压缩模量没有明显影响[43]。细胞可以通过贯穿于支架全层存在的激光微刻孔道，短时间内即可渗透与定植于支架内部。随着细胞培养的时间增加，表层细胞逐渐向支架内层迁移分布，经过24 h的培养，在具有120 μm的孔道直径、厚度约为2 mm的支架中可以形成基本均匀的细胞分布[43]。

激光微刻支架能够进一步增强细胞定植早期的代谢活性，并在细胞黏附、稳定及增殖的过程中，提供更大的细胞与支架间的接触面积，以及营养运输渠道，使培养过程中的细胞密度也明显高于非激光微刻支架。生物材料支架经过细胞培养后，由于细胞分泌消化酶的作用会导致材料初期的机械性能下降，而细胞外基质的不断分泌与沉积则会增强材料的机械性能。无孔道支架由于细胞大部分被限制于支架表层，没有表现出明显的机械性能的上升。而激光微刻支架由于孔道的存在，使细胞在支架内能够更均匀地分泌基质，从而使支架的机械性能在下降前就出现了显著的提高，并始终高于非激光微刻支架。因此，LMP支架的特殊结构使软骨脱细胞外基质支架性能获得了显著的提升[38-40，43]。

在组织工程支架中通过各种方法引入孔结构，具有相似的增强细胞渗透性和机械性能的效果，而孔隙的参数不同(例如直径、密度、高度)也对细胞的生物学行为以及支架的力学性能产生一定影响。除一维方向上的孔隙结构，更复杂、与天然软骨更相似的组织工程支架结构的构建也有待于进一步的探索研究。

6 总结

软骨组织的组织结构致密、缺乏血管且细胞成分少，关节区的软骨还需要承担较大的生物力学负载。由于软骨组织的特殊性能，一些应用于其他组织类型的提高脱细胞基质支架孔隙率的方法在软骨组织中并不适用。例如，超声处理能够清除微小胶原纤维，提高动脉组织脱细胞支架孔隙率[44]，但在软骨中的应用则没有明显效果[15]。

软骨的组织特性决定了软骨组织工程支架具有特殊的要求。脱细胞基质支架作为一种成分与结构均与天然组织最为相似的天然生物材料，在软骨组织中的应用尚存在一定的缺陷，尚待研究，主要表现在：脱细胞方案与效果评价尚未形成统一标准，同种异体移植物的组织来源或异基因移植物的免疫学机制，模拟天然软骨组织的组织成分、形态结构、细胞分布，构建符合一定生理需要并能持续维持的机械性能。其中，支架微观孔隙结构的构建对新生组织形态结构、细胞在支架中的渗透与分布，以及支架机械性能的构建起到了重要的作用。因此，对支架微观孔隙结构的探索在未来的研究中不可或缺，从而使得支架的性能得到进一步的完善，使ECM生物支架在组织工程和生物医学领域发挥更大的作用。

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