解毒化瘀汤对活动期溃疡性结肠炎Th17/Treg细胞及其细胞因子的影响*

李丹丹 袁星星 杨 磊 王炳予 刘长发 张雅丽

（黑龙江省中医药科学院南岗分院，黑龙江 哈尔滨 150001）

溃疡性结肠炎（UC）是一种病因及发病机制尚不清楚的以侵犯结肠和直肠的黏膜及黏膜下层为主要特征的非特异性炎症，病变呈连续性、弥漫性分布，多从直肠开始，逐渐累及全结肠甚至回肠末端，其临床表现为持续或者反复发作的腹痛腹泻、黏液样脓血便、里急后重和不同程度的周身症状［1-2］。越来越多研究发现［3］，多种细胞因子参与肠道黏膜的炎症免疫反应在UC发病及其转归过程中具有重要的作用，而T淋巴细胞作为人体免疫系统的重要组成部分，尤其是介导炎症反应的辅助性T细胞17（Th17）和介导免疫耐受的调节性T细胞（Treg）细胞平衡与UC密切相关。解毒化瘀汤为本文通信作者名中医张雅丽教授的经验方，已被本科用来治疗湿热蕴结型活动期UC患者，不仅疗效显著，而且无明显的不良反应。为了传承及继承其学术经验，本研究通过探讨解毒化瘀汤对湿热蕴结型活动期UC患者Th17/Treg细胞及其相关细胞因子的影响，进一步明确其作用机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 西医诊断标准参考《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2012 年·广州）》［4］中活动期 UC 相关诊断标准；中医诊断标准参考《溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见》［5］中湿热蕴结证。纳入标准：符合活动期UC西医和湿热蕴结证中医诊断标准；年龄20～65岁；签署临床伦理研究知情同意书者。排除标准：缓解期、爆发性溃疡性结肠炎者；3个月内应用糖皮质激素、水杨酸制剂、止泻药等UC治疗者；克罗恩病、放射性结肠炎、缺血性结肠炎或肠结核者；伴严重并发症或胃、十二指肠溃疡、肝功能异常、消化系恶性肿瘤者；伴有呼吸、循环、泌尿、内分泌、神经系统严重疾病；既往有水杨酸制剂过敏史者；妊娠期、准备妊娠及哺乳期妇女。剔除标准：患者依从性差，自行加药或停药者；资料不全影响疗效，影响安全性者。脱落标准：患者在临床试验中因各种原因不愿意继续者；发生严重并发症，不宜继续参加本试验者。

1.2 临床资料 选取2016年9月至2017年1月于黑龙江省中医药科学院南岗分院消化科门诊及住院处就诊的UC患者48例，按照就诊先后顺序编号，分配选取的随机数字，再对随机数字进行处理，分为对照组和治疗组各24例。两组患者性别、年龄、病程、发病类型、程度及发病部位等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。

表1 两组患者一般资料比较

1.3 治疗方法 对照组给予美沙拉嗪肠溶片 （葵花药业集团有限公司，国药准字H19980148，规格：每片0.25 g）口服，每次1 g，每日4次。治疗组在对照组基础上给予解毒化瘀汤：白头翁25 g，黄连20 g，黄芩15 g，黄柏 10 g，半枝莲 15 g，马齿苋 10 g，丹参 15 g，血竭 15 g，赤芍 15 g，三七 5 g，白芍 10 g，木香 10 g。由本院中药制剂室统一熬制，每剂煎500 mL，分2袋，早晚饭后温服。两组疗程均为12周，疗程结束后随访12周。

1.4 观察项目 1）细胞因子检测。分别于治疗前、后收集两组患者清晨空腹静脉血，室温环境凝固30 min后以2500 r/min离心10 min，上清液于-20℃保存。采用ELISA法检测白细胞介素-17（IL-17）、白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）的浓度，检测步骤严格按照试剂盒说明书。2）Th17/Treg细胞的核转录因子检测。分别于治疗前、后收集两组患者外周血并分离其单一核细胞（PMBC）后进行总RNA的提取，并鉴定RNA的纯度、浓度及完整性。按照逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。RT-PCR引物均由大连TaKaRa 有限公司合成（RORγt引物上游：5′-CTGCAA GACTCATCGCCAAAG-3′， 下游：5′-TTTCCACATGCT GGCTACACA-3′；Foxp3 引物上 游：5′-GGGTAGCCA TGGAAACAGCA-3′， 下游：5′-TC GCATGTTGTGGAA CTTGAAGTAG-3′；内参 β-actin 引物上游：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′， 下游：5′-ATGCTATCA CCTCCCCTGTGTG-3′）。采用ABI 7500 PCR仪对合成的cDNA进行扩增，扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到每个PCR反应管不同指标的Ct值后，采用2-△△CT法计算各个指标经内参β-actin标化后的相对浓度。

1.5 疗效标准 参照《溃疡性结肠炎中西医结合诊疗指南（草案）》中疗效标准［6］。完全缓解：临床症状消失，肠镜显示黏膜病变基本消失或主要症状及肠黏膜病变活动指数总分值降低≥95%。显效：临床主要症状明显缓解，肠镜显示黏膜病变明显减轻或主要症状及肠黏膜病变活动指数总分值降低≥70%。有效：临床主要症状有所缓解，肠镜示黏膜病变有所减轻或主要症状及肠黏膜病变活动指数总分值降低≥30%。无效：经治疗后临床症状、内镜及病理检查结果均无改善或加重，或主要症状及肠黏膜病变活动指数总分值降低＜30%。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组临床疗效比较 见表2。疗程结束后，治疗组总有效率91.67%，对照组为75.00%，两组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 两组临床疗效比较（n）

2.2 两组治疗前后细胞因子水平比较 见表3。两组治疗后IL-17较治疗前均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），治疗后治疗组明显优于对照组，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.01）；两组治疗后IL-10、TGF-β较治疗前均明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.01），治疗后治疗组明显优于对照组，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表3 两组治疗前后细胞因子水平比较（pg/mL，±s）

表3 两组治疗前后细胞因子水平比较（pg/mL，±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组治疗后比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

组 别 时 间 TGF-β IL-17 IL-10治疗组 治疗前 35.98±11.09（n＝24） 治疗后 62.22±13.05**△△对照组 治疗前 32.31±12.14 474.52±34.26 157.39±36.15 215.17±23.57**△△ 286.17±44.21**△△457.97±36.28 167.52±34.59（n＝24） 治疗后 45.15±10.07**318.13±26.77** 213.54±32.96**

2.3 两组治疗前后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相对表达量比较 见表4。两组治疗后RORγt mRNA较治疗前均明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01），治疗后组间比较，差异明显（P＜0.01）；两组治疗后Foxp3mRNA较治疗前均明显升高（P＜0.01），治疗后组间比较，差异具有统计学意义 （P＜0.05）；两组治疗后RORγt/Foxp3比值较治疗前均明显降低 （P＜0.01），治疗后组间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表4 两组治疗前后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较（±s）

表4 两组治疗前后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较（±s）

组 别 时 间 RORγt/Foxp3 RORγt mRNA Foxp3 mRNA治疗组 治疗前 6.58±1.09（n＝24） 治疗后 1.28±0.05**△对照组 治疗前 5.91±1.14 9.15±1.26 1.39±0.45 4.07±1.07**△△ 3.17±1.21**△8.97±1.31 1.52±0.59（n＝24） 治疗后 2.02±0.37**5.13±1.15** 2.54±1.06**

2.4 不良反应 两组治疗过程中均无病例退出、失访，且无明显不良反应事件发生。对照组随访复发6例，复发率33.33%，治疗组随访复发3例，复发率13.64%，两组复发率组间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

UC是由遗传、环境、免疫等多因素参与的炎症性疾病，促炎因子的增多和抗炎因子的相对减少是引起肠黏膜免疫反应异常和慢性炎症的主要原因。Th17细胞因能够分泌IL-17而命名，是一种新发现的辅助性淋巴细胞亚群，除此之外，Th17还能够分泌IL-6、IL-23及TNF-α等多种炎性细胞因子，在UC的发病及肠道黏膜的修复过程中起着重要的作用［7］。IL-17一方面通过诱导IL-6、GM-CSF和CAM-1等基因的表达从而增强TNF-α、IL-1诱导的炎症反应，另一方面还能通过诱导巨噬细胞释放促炎因子，对UC的炎症反应起着重要的作用［8］。 研究表明［9-10］，活动期 UC 血清 IL-17明显高于缓解期UC及正常对照组，且IL-17还可以在一定程度上评价患者的病情程度及短期治疗后的黏膜愈合能力。Treg细胞不同于其他CD4+T细胞介导的免疫炎症反应，是一类具有炎症抑制作用的CD4+细胞亚群，其一方面通过分泌大量TGF-β、IL-10等抗炎因子来抑制巨噬细胞、树突状细胞和Th细胞等促炎性细胞因子的释放，另一方面通过负性调控抑制Th17细胞的生成和IL-17的分泌，从而抑制炎症产生及扩大，从而调控炎症反应及维持人体肠道的免疫耐受［11］。实验研究表明［12］，Treg细胞通过增加TGF-β和IL-10的分泌抑制肠道的炎症反应，可以显著改善UC模型小鼠的腹泻症状。当肠上皮出现障碍时，通过刺激树突状细胞的成熟和分泌IL-6从而上调核转录因子RORγt的表达，诱导IL-23R的表达进而促进Th17的分化及产生IL-17，诱导肠道的炎症反应；当IL-6水平降低时，TGF-β通过上调核转录因子Foxp3的表达进而促进Treg细胞的形成，抑制过度的炎症反应［13］。因此Th17与Treg的平衡在UC的发病过程中起着重要的作用，同时RORγt与Foxp3也成为恢复Th17与Treg之间的平衡与UC疾病恢复的新免疫靶点。

中医学认为溃疡性结肠炎属于“泄泻”“肠癖”等范畴，本病多因饮食不节或不洁，嗜食辛辣刺激之物，导致湿浊蕴结脾胃，困阻中焦，瘀而化热，湿热下注大肠，阻滞气机以致血瘀，故湿热、血瘀交杂贯穿本病全过程，湿热交杂缠绵不愈，反复发作，病程较长。以清热解毒、活血化瘀为治则的解毒化瘀汤，临床疗效确切能够明显改善UC患者的临床症状。其中白头翁性苦、寒，归胃、大肠经，清热解毒、凉血止痢，既能清胃肠治湿热，又能清血分治热毒。黄连性苦、寒，归心、大肠经，清热燥湿、泻火解毒，两药共为君药，发挥清热解毒止痢功效。现代研究表明，白头翁汤不仅可以显著抑制痢疾杆菌，还能够显著抑制金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，具有良好的抗炎止痢作用［14］。黄芩苦、寒，清热燥湿，泻火解毒，止血；黄柏苦、寒，清热燥湿、泻火解毒。实验研究表明［15］，黄芩提取物能够显著抑制NOS，从而减少NO的释放，调节AA的代谢，抑制PGE2和LT的合成，发挥抗炎作用。半枝莲清热解毒、化瘀利尿，马齿苋清热解毒、凉血止血，实验发现，马齿苋能改善UC大鼠的一般状态，显著减轻结肠组织的病损程度，使得病变范围减小，黏膜缺损变浅，中性粒细胞浸润减少，促进溃疡愈合，对UC炎症急性期具有一定疗效［16］。丹参活血祛瘀止痛，赤芍清热凉血、散瘀止痛，血竭活血化瘀、去腐生肌，研究表明，血竭能够既可以扩张血管，改善肠道黏膜的血液循环，抑制血栓的形成，同时又能够清除氧自由基，降低炎症发生，达到抗炎止痛及抗肿瘤的作用［17］。三七消炎散肿、化瘀止血、化腐生机，此8药共为臣药，瘀祛则湿热之邪易除。白芍养血坚阴、柔肝止痛，木香行气理气，健脾消滞，共为佐使。有实验研究表明，白芍总苷能够明显减轻UC模式组织学的损伤，其作用机制可能是通过减少TNF-α的表达，抑制NF-κB的活化来实现的［18］。综上全方，共奏清热解毒利湿，行气化瘀止痛之功。

本研究发现治疗组总有效率为91.67%，两组治疗后IL-17较治疗前均明显降低（P＜0.01），两组治疗后IL-10、TGF-β较治疗前均明显升高，组间比较，治疗组明显优于对照组。两组治疗后RORγt mRNA、RORγt/Foxp3比值较治疗前均明显降低，Foxp3 mRNA较治疗前均明显升高，组间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，解毒化瘀汤能够明显改善湿热蕴结型活动期UC炎患者临床症状，减少复发率，其作用机制可能是通过调控RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的表达，降低IL-17水平，升高IL-10、TGF-β水平，从而促进Th17与Treg之间的平衡实现的。

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