饲料中添加中性蛋白酶对吉富罗非鱼生长和消化功能的影响

赵觅美+齐遵利+张秀文

摘 要：在吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）基础饲料中添加中性蛋白酶，添加量分别为0.00%、0.05%、01%、0.15%、0.2%和0.25%，研究添加后对吉富罗非鱼生长和消化功能的影响。结果表明，在饲料中添加0.1%～0.25%的中性蛋白酶，吉富罗非鱼的相对增重率和特定生长率显著提高，饲料系数显著降低（P<005）；添加0.1%～0.2%的中性蛋白酶，显著提高饲料干物质表观消化率和粗蛋白表观消化率（P<005）；添加量为0.1%～0.15%时，肝胰脏蛋白酶显著高于对照组（P<0.05），添加量为0.15%时，肠道蛋白酶活性显著提高（P<0.05）。综合鱼体相对增重率、特定生长率、饲料系数、消化器官消化酶活性等各项指标，吉富罗非鱼饲料中中性蛋白酶的添加量以饲料的0.1%～0.2%为宜。

关键词：吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）；中性蛋白酶；生长；表观消化率；消化酶

目前在水产养殖中，对酶制剂的活性研究较多[1-2]，而对水产动物的生长性能和消化率研究的相对较少。与此同时，酶制剂品种很多，数量多达20余种，但常用的只有少数几种。在国外，木聚糖酶用量最大，其次是β-葡聚糖酶，其它几种酶制剂使用相对较少。近几年国内在非淀粉多糖酶和复合酶制剂的研究较多[3-5]，但对于饲料中添加外源性消化酶的研究较少。本文通过在鱼粉含量较低而植物蛋白较高的吉富罗非鱼饲料中加入中性蛋白酶，进行饲养试验，研究中性蛋白酶对吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）的生长、表观消化率及消化酶活性的影响，旨在探讨中性蛋白酶在吉富罗非鱼饲料中的应用效果和适宜的添加量。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

在基础饲料中分别加入不同浓度（0、0.05%、0.1% 、0.15%、0.2%、0.25%）的中性蛋白酶（活性50 000 U/g）配成试验饲料，每组3个平行。试验饲料制备时准确称取相应质量的中性蛋白酶与黏合剂（红薯淀粉）混合，加入少量蒸馏水，搅匀后均匀喷洒到基础饲料上，自然风干分装，在常温下避光保存备用，每次拌料以5 d左右的投喂量为宜。

1.2 試验条件

所用水族箱规格为110 cm×60 cm×80 cm，为自动循环水养殖系统。试验用鱼平均体重为（92.65±4.84）g/尾。

1.3 饲养管理

采用循环水养殖，根据水质情况适当换水。试验期间每天投饵2次，投饵时间分别为8：00和16：00。每天的投喂量相对稳定，各水族箱间投饵量也相对稳定，每次投喂以10 s时间吃完没有残饵为宜。全天24 h不间断充气。试验期间水温保持在 25～30 ℃，pH为 7.0～7.5。随时观测鱼的活动、摄食情况，发现病鱼，及时进行检查，分析原因，采取相应的治疗措施。

1.4 生长指标的测定

试验开始前，对每个水族箱中的吉富罗非鱼分别进行计数、称重。饲养56 d后，停食24 h，对每组水族箱中所剩吉富罗非鱼进行计数、称重，空腹测定各组水族箱中吉富罗非鱼终末体重，计算各试验组吉富罗非鱼的试验初尾均重、试验末尾均重、成活率、相对增重率、特定生长率和饲料系数。

1.5 饲料消化率的测定

饲料消化率采用水产动物表观消化率测定方法（NY/T 2713-2015）。采用逐级稀释的方法提前将Cr2O3混匀后均匀地加入到吉富罗非鱼配合饲料中，添加量为1%。使用的Cr2O3为化学纯，研碎后经过100目筛。计算出饲料干物质表观消化率、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维的表观消化率。

1.6 吉富罗非鱼消化器官消化酶活性的测定

1.6.1 消化器官样品的采集及酶液的制备 消化器官样品的采集：饲养试验结束后，投喂试验饲料2 h左右，在每个处理组中分别随机捞取3尾吉富罗非鱼，将3尾吉富罗非鱼解剖的肝胰脏样品混合成一个样品、将解剖的3个肠道样品混合成一个样品。操作如下：将吉富罗非鱼从水簇箱中捞出，立即解剖，分别取出肝胰脏和肠道，放在有冰浴的培养皿上，此操作需在0～4 ℃条件下进行。分别剪除吉富罗非鱼肝胰脏、肠道外壁或表面上的脂肪，用滤纸沾去肝胰脏、肠道上的血块。

组织匀浆酶液的制备：取出肠道的内容物，用4 ℃的冷却蒸馏水将肠道内壁冲洗干净，再用洁净的滤纸将肠道样品表面水分吸除，然后用解剖剪将肠道剪碎，在分析天平上进行称重（精确至0.01 g以上），将剪碎的肠道组织放入玻璃匀浆器中，加入适量4 ℃的冷却蒸馏水，在冰浴中对肠道组织进行匀浆，再用4 ℃的冷却蒸馏水将肠道组织匀浆液冲冼至离心管中，3次所用冷却蒸馏水的重量为吉富罗非鱼肠道样品重量的10倍。然后在4 ℃条件下以6 000 r/min的转速将肠道组织匀浆液离心15 min，取其上清液做好标记后进行分装，即为待测配液，放在4 ℃冰箱中保存，需要在24 h内测定完毕。用同样的方法制备吉富罗非鱼肝胰脏组织匀浆待测酶液，放在4 ℃冰箱中保存，同样需在24 h内测定完毕。

1.6.2 蛋白酶活性测定 采用Forlin-酚试剂法进行测定。

1.6.3 淀粉酶、脂肪酶活性测定 采用淀粉酶、试脂肪酶剂盒比色法分别进行淀粉酶活性、脂肪酶的测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.7 数据统计与分析

试验数据采用（平均数±标准差）的方法进行表示，用 SPSS17.0 进行单因素方差分析，并结合Duncan 氏法进行多重分析比较，差异显著水平为 P<0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加中性蛋白酶对吉富罗非鱼生长的影响

试验吉富罗非鱼摄食中性蛋白酶含量分别为0、0.05 %、0.10%、0.15%、0.20%和 0.25%的试验饲料56 d后，得到中性蛋白酶对各试验组吉富罗非鱼生长影响见表1。endprint

由表1可知，试验饲料中中性蛋白酶含量为0.1%～0.25%时，相对增重率和特定生長率均比A0和A1组显著提高，饲料系数显著降低（P<005），它们之间差异不显著（P> 0.05）。以02%添加的A4组相对增重率和特定生长率最高，饲料系数最低。吉富罗非鱼在整个试验期间成活率均无显著性差异（P>0.05）。

2.2 饲料中添加中性蛋白酶对饲料表观消化率的影响

饲料中添加不同含量的中性蛋白酶对饲料表观消化率测定结果见表2。

由表2可知，中性蛋白酶含量为0.1%～02%的各试验组的干物质表观消化率均显著高于空白对照组A0（P<0.05），各试验组之间无显著差异（P>0.05），当中性蛋白酶含量增加到025%时，干物质表观消化率反而有所下降，但与其他试验组和对照组均无显著差异（P>0.05）。中性蛋白酶含量为0.05%～0.25%的各试验组的粗蛋白表观消化率均显著高于空白对照组A0（P<0.05），但各试验组之间无显著差异（P>005）。各试验组的粗脂肪表观消化率和粗纤维表观消化率与对照组之间均无显著差异（P>005）。

2.3 饲料中添加中性蛋白酶对消化酶活性的影响

饲料中添加不同含量的中性蛋白酶对消化酶活性的影响测定结果见表3。

由表3可知，吉富罗非鱼摄食试验饲料56 d后，其肝胰脏淀粉酶、肠淀粉酶、肝胰脏脂肪酶和肠脂肪酶在各试验组间均无显著差异（P>005）；肝胰脏蛋白酶活性随着饲料中蛋白酶含量从0增加0.05%和0.1%而逐渐升高，然后随中性蛋白酶含量继续增加而逐渐降低，A2和A3组的肝胰脏蛋白酶活性显著高于空白对照组A0和A5组（P<0.05），A2和A3组间则无显著差异（P>0.05）；肠蛋白酶活性随着饲料中蛋白酶含量从0增加0.15%而逐渐升高，以A3组的肠蛋白酶活性最高，显著高于空白对照A0组和A5组（P<0.05），其他各试验组与A0组均无显著差异（P>0.05），A5组的肠蛋白酶活性低于A0组，但差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

3.1 对吉富罗非鱼生长性能的影响

目前中性蛋白酶在水产动物配合饲料中的应用研究的还比较少。冷向军（2008）等研究表明，在鱼粉含量分别为6%、10%的鲤鱼配合饲料中分别添加同样含量的蛋白酶AG ， 鲤鱼的增重率均能显著提高、饲料系数明显降低；但在鱼粉含量为15%和20%的鲤鱼配合饲料中分别添加同样含量的蛋白酶 AG后， 鲤鱼的增重率和饲料系数与对照组相比均无显著的差异[6]。 陈建明等（2009）在体重为3 g左右的青鱼鱼种配合饲料中添加0.1%～0.3%的中性蛋白酶制剂，能显著地提高青鱼的增重率、降低鲤鱼的饲料系数、提高经济效益[7]。

本试验中，在吉富罗非鱼配合饲料中添加01%～0.25%的中性蛋白酶，罗非鱼的增重率和特定生长率均能得到显著的提高，饲料系数得到明显的降低。这与大多数研究者的研究结果相类似。本试验吉富罗非鱼的基础饲料中鱼粉含量较低，以豆粕等为主的植物性蛋白含量较高。分析其原因可能是由于植物蛋白含量较高的吉富罗非鱼配合饲料中氨基酸存在不平衡的现象，且存在着胰蛋白酶抑制剂等多种抗营养因子，饲料蛋白质的消化率较低，添加外源性中性蛋白酶后，不但补充了蛋白酶的数量，且外源性蛋白酶使饲料植物性蛋白中的抗胰蛋白酶的作用得到钝化，消弱了其对饲料消化的负面影响，饲料蛋白质的消化率和饲料利用效率得到了提高，使蛋白质更好地用于鱼体的生长，同时配合饲料的适口性也得到了改善，最终表现出吉富罗非鱼生长速度的提高和饲料系数的降低。

3.2 对饲料表观消化率的影响

评价配合饲料营养价值的重要指标之一是饲料的表观消化率。不同种类的饲料原料对饲料消化率的影响尤为重要，不同的物质在鱼体内消化时，在相应的消化酶如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等作用下，蛋白质、脂肪、淀粉等水产动物不可直接吸收的大分子营养物质会降解成氨基酸、脂肪酸、葡萄糖等水产动物可直接吸收的小分子营养物质。豆粕作为主要的植物蛋白源，虽然其粗蛋白含量较高，但其内含有抗胰蛋白酶、大豆蛋白抗原等抗营养物质，容易引起饲料消化率降低，也有可能引起动物中毒等不良反应。而在配合饲料中添加一定剂量的蛋白酶会消除抗胰蛋白酶等配合饲料中的抗营养因子，补充动物体自身蛋白质消化酶的分泌不足，保护动物肠道绒毛膜的完整性，促进动物机体对蛋白质等营养物质的消化和吸收，提高配合饲料中蛋白质等营养物质的利用效率[8]。 Drew等（2005）在以菜粕、豌豆为主要蛋白源的虹鳟鱼配合饲料中添加一定量的蛋白酶，虹鳟鱼对配合饲料中营养物质的消化率得到了显著提高[9]。陈建明等（2009）在体重为3 g左右的青鱼鱼种配合饲料中添加0.05%～0.3%的中性蛋白酶制剂蛋白质表观消化率得到显著的提高， 而对饲料干物质的表观消化率没有显著影响[7]。

本试验中在吉富罗非鱼配合饲料中添加中性蛋白酶对饲料粗脂肪表观消化率和粗纤维表观消化率均无显著影响，中性蛋白酶添加量为0.1%～0.2%的各试验组的干物质表观消化率和粗蛋白表观消化率均显著高于空白对照组。与陈建明、奚刚、Drew等的研究结果基本一致。本试验中当中性蛋白酶添加量增加到0.25%时，饲料蛋白质的表观消化率有所降低，这可能是因为动物自身的蛋白质消化酶已足够多，添加了外源蛋白酶反而抑制了动物消化道内消化酶的分泌及其活性。

3.3 对消化器官消化酶活性的影响

蛋白酶是蛋白质代谢过程中非常重要的一类消化酶，能催化分解肽键，将大分子的蛋白质降解为蛋白胨、肽和氨基酸等小分子的营养物质，从而促进蛋白质的消化，提高动物对蛋白质的消化率和饲料利用率。国内外有关在饲料中添加外源蛋白酶对水产动物消化器官消化酶活性影响的研究不是很多。冷向军等（2008）研究表明，在鲤鱼配合饲料（鱼粉含量为 10%）中添加蛋白酶 AG 175 mg/kg 后，鲤鱼肠道内蛋白酶的活性得到了显著提高[6]。陈建明等（2009）研究表明，在体重3 g左右的青鱼鱼种配合饲料中添加0.1%～0.3%的中性蛋白酶制剂，显著提高了青鱼的肝胰脏蛋白酶活性， 而对青鱼肠道蛋白酶、肠道淀粉酶和肝胰脏淀粉酶的活性没有产生显著性的影响[7]。endprint

本試验中在吉富罗非鱼配合饲料中添加02%的中性蛋白酶，显著提高了吉富罗非鱼肝胰脏蛋白酶和肠道蛋白酶的活性，而对鱼的肝胰脏淀粉酶、脂肪酶活性和肠道淀粉酶、脂肪酶活性没有产生显著影响。这与陈建明、冷向军等的研究结果基本一致。在配合饲料中添加外源性蛋白酶能提高吉富罗非鱼肝胰脏和肠道蛋白酶活性的原因可能是一方面添加的外源性蛋白酶直接参与了对配合饲料营养成分的降解，另一方面也促进了内源性蛋白酶的分泌，提高了肝胰脏和肠道蛋白酶的活性，内源性蛋白酶与外源性蛋白酶发生协同作用，共同提高鱼对饲料营养成分的消化和吸收，从而提高吉富罗非鱼对饲料的利用效率，罗非鱼摄食较多的蛋白质后又可促进罗非鱼的生长。

4 结论

本试验条件和营养水平下，在吉富罗非鱼饲料中添加0.1%～0.2%的中性蛋白酶能显著地提高吉富罗非鱼的相对增重率和特定生长率，提高饲料报酬，降低饲料系数，显著提高饲料干物质、粗蛋白表观消化率，提高吉富罗非鱼肝胰脏和肠道内蛋白酶的活性。综合鱼体相对增重率、特定生长率、饲料系数、消化器官消化酶活性等各项指标，吉富罗非鱼饲料中中性蛋白酶的添加量以饲料的0.1%～0.2%为宜。

参考文献：

[1]

关胜军，吴锐全，谢骏等.饥饿对大口黑鲈消化器官、蛋白酶和淀粉酶活力的影响[J].南方水产，2007，2：25-29.

[2] 余德光，王广军，谢骏等.斜带石斑鱼消化器官的蛋白酶和淀粉酶活力变化[J].浙江海洋学院学报（自然科学版），2007，3：246-251.

[3] 陈应华.复合酶制剂对彭泽鲫生长性能的影响试验[J].饲料工业，2001， 22（3）：27-28.

[4] 陈京华.非淀粉多糖酶对牙鲆消化酶和饲料消化率的影响[J].中国农学通报.2009，13：268-272.

[5] 钟国防， 周洪琪.木聚糖酶和复合酶制剂 PS 对尼罗罗非鱼生长性能、非特异性免能力的影响[J].海洋渔业，2005，27（4）：286-291.

[6] 冷向军，刘鼎云，李小勤等.饲料中添加蛋白酶 AG 对鲤鱼鱼种生长和蛋白质消化酶活性的影响[J]. 动物营养学报， 2008， 20（3）： 268-274.

[7] 陈建明，叶金云，许尧兴等.饲料中添加中性蛋白酶对青鱼生长、消化及鱼体组成的影响[J].水生物学报，2009，33（4）：726-731.

[8] 乔玉锋，孙鸡，陆文清.饲用酶制荆的应用及存在的问题[J].中国饲料，2001，7：28～29.

[9] Drew M D， Racz V J， Gauthier R， et al.Effect of adding protease to co-extruded flax：pea or canola：pea products on nutrient digestibility and growth performance of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）.Animal Feed Science and Technology，2005， 119：117-128.

（收稿日期：2017-12-11）endprint