钙网织蛋白在早期类风湿关节炎中的表达及其与自身抗体和炎性细胞因子的关系

丁红梅 ，刘建华 ，贾曙光 ，赵雁艳 ，魏蔚 ，郑芳

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种免疫介导的慢性炎性关节病，以滑膜组织增生、新生血管形成、多种细胞及细胞因子浸润为主要特征。RA的病因和发病机制较复杂，目前仍不十分清楚。近年来研究显示，钙网织蛋白可能与RA的发病密切相关。钙网织蛋白是一个多功能的蛋白质分子，在内质网、细胞质、细胞膜表面及胞外环境中均表达，并参与多种生物学活动，如细胞的黏附和迁移、抗原呈递、细胞凋亡的调节以及抗肿瘤免疫应答等过程［1-3］。钙网织蛋白在RA患者体内表达升高，且与滑膜炎和新生血管形成有关［4-6］。本研究在以往研究的基础上进一步探讨钙网织蛋白在早期RA患者中的表达特点及其与自身抗体和炎性细胞因子的关系，为临床寻找新的血清学指标提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2014年10月—2016年12月在唐山市第二医院关节科和天津医科大学总医院感染免疫科就诊的患者。血清标本包括早期活动性RA患者106例（活动性RA组），稳定期RA患者95例（稳定期RA组，均来自早期活动性RA患者），骨性关节炎（OA）患者85例（OA组）。所有入选的早期活动性RA患者病程小于12个月，且均未经缓解病情抗风湿药物（disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）或生物制剂治疗，诊断均符合2010年美国风湿病学会及欧洲抗风湿病联盟（ACR/EULAR）修订的最新诊断标准［7］。稳定期RA患者的临床诊断标准参照ACR/EULAR 2011类风湿指南［8］。所有OA患者均符合OA的临床诊断标准。选取同期收集的来自唐山市第二医院的80例性别、年龄匹配的健康体检者作为健康对照组（HC组），各组基线资料见表1。本研究获得河北省唐山市第二医院伦理委员会批准，且标本采集均取得受试者的知情同意。

Tab.1 Clinical characteristics in four groups of patients表1 研究对象的基线临床资料

1.2 主要试剂与仪器 人钙网织蛋白检测试剂盒购自上海鑫乐生物科技有限公司，采用BioTek Synergy 2酶标仪（美国Biotek公司）进行检测。人全血CRP采用Nephstar Plus蛋白分析仪（深圳市国赛生物技术有限公司）及其配套试剂盒进行检测。类风湿因子（RF）的检测采用日立7600全自动生化分析仪及其配套试剂。抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP）检测试剂盒购自上海科新生物技术股份有限公司。人白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α 检测试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 方法 采集早期活动性RA患者治疗前和治疗后处于稳定期的静脉血各2 mL，分离血清，分装后-80℃保存。血清钙网织蛋白、IL-1β、IL-6、TNF-α 及 anti-CCP均采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行检测，严格按照试剂盒说明书操作。anti-CCP阳性标准为≥25 RU/mL。ESR采用魏氏法检测，正常参考值为男＜15 mm/1 h，女＜20 mm/1 h。CRP及RF采用免疫比浊法检测，阳性标准为CRP≥10mg/L，RF＞20IU/mL。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2 组间均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q检验。相关性分析采用Spearman等级相关，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清钙网织蛋白水平比较 活动性RA组、稳定期RA组、OA组和HC组血清钙网织蛋白含量分别为（5.84±2.62）µg/L、（4.26±1.42）µg/L、（3.92±1.10）µg/L、（3.86±0.91）µg/L，差异有统计学意义（F=28.696，P＜0.001），活动期 RA 组患者血清钙网织蛋白含量明显高于其他3组（P＜0.001），而后3组间血清钙网织蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 血清钙网织蛋白水平与RA自身抗体的关系 活动性RA患者RF阳性组血清钙网织蛋白含量［（6.12±2.87）µg/L，n=81］高于 RF 阴性组［（4.92±1.22）µg/L，n=25，t=2.029，P=0.045］；anti-CCP 阳性组钙网织蛋白含量［（6.39±2.93）µg/L，n=72］高于anti-CCP 阴性组［（4.69±1.17）µg/L，n=34，t=3.256，P=0.002］。

2.3 血清钙网织蛋白与炎性因子的相关性分析 经正态性检验，4个因子并不是均服从正态分布，采用等级相关分析。早期活动性RA患者血清钙网织蛋白水平与血清炎性细胞因子IL-1β（rs=0.386，P=0.009）、IL-6（rs=0.405，P=0.006）及 TNF- α（rs=0.428，P=0.003）均呈正相关，见图 1。

Fig.1 The correlations between calreticulin and IL-1β,IL-6 and TNF-α in patients with active RA图1 活动性RA患者血清钙网织蛋白与IL-1β、IL-6及TNF-α的相关分析散点图

3 讨论

RA在全世界范围内具有较高的发病率，且呈上升的趋势。早期诊断、早期治疗控制疾病活动是改善RA患者的预后及降低其致残率的关键。血清学指标是临床上RA早期诊断及预后判断的重要依据，但目前尚没有理想的血清学指标可用来早期诊断和准确预测RA疾病进展程度［9-11］。随着临床RA诊疗的个性化及多种生物标志物的综合应用，寻找更特异、更敏感的血清学标志物指导RA的早期个性化诊疗具有十分重要的临床意义。

3.1 RA患者血清钙网织蛋白表达水平 既往研究显示，钙网织蛋白在RA患者体内表达升高，并且在RA发病机制中发挥了重要作用［4-6］。本研究纳入未经DMARDs或生物制剂治疗的初治RA患者及经治疗后达到稳定期的RA患者进行研究，分析早期RA患者体内钙网织蛋白的表达特点及治疗前后钙网织蛋白表达的差异。结果发现，早期活动性RA患者血清钙网织蛋白表达水平明显升高，该结果与以往的研究结果具有一致性［4-5］，提示钙网织蛋白可能成为RA早期诊断的潜在血清学新指标。而且笔者发现经DMARDs或生物制剂治疗达到稳定期后，伴随病情好转的RA患者血清钙网织蛋白水平明显降低，该指标可能是评估药物治疗效果的较敏感指标。

3.2 钙网织蛋白与RA自身抗体的关系 自身抗体是目前RA最重要的血清学标志物。2010年RA新的分类标准中包括RF和anti-CCP这两种自身抗体，新标准更有助于RA的早期诊断［7］。因此，本研究接下来探讨血清钙网织蛋白水平与RF和anti-CCP的关系。结果发现，早期活动性RA患者RF阳性和anti-CCP阳性组血清钙网织蛋白水平明显高于RF阴性和anti-CCP阴性组。自身抗体不仅用于诊断，还与RA患者的预后密切相关。以往研究表明，anti-CCP阳性的RA患者比anti-CCP阴性的患者疾病更具有侵袭性［12］。本研究显示，钙网织蛋白在阳性RF及anti-CCP患者中表达升高，提示其不仅有助于RA的早期诊断，还可能与RA患者的预后密切相关。

3.3 钙网织蛋白与炎性细胞因子的关系 为了进一步探讨钙网织蛋白在RA早期诊断和预后评估中的作用，本研究分析了其与炎性细胞因子的相关性。目前研究证实多种细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-28、IL-23参与了RA发病的病理过程，并且与疾病的进展密切相关［13］。本研究发现，早期活动性RA患者血清钙网织蛋白水平与细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α均呈正相关，该结果支持上述观点，即钙网织蛋白可能在RA早期诊断和预后评估中发挥了重要作用。由于本研究纳入的样本例数偏少，想证实这一点还需要扩大样本量进行深入研究。

综上所述，本研究发现早期活动性RA患者血清钙网织蛋白水平明显升高，且与自身抗体、促炎性细胞因子水平均相关，钙网织蛋白可能是RA早期诊断及预后评估的潜在血清学新指标。

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