黄淮区粳稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm的分子检测

陈 峰, 徐建第, 姜明松, 梁水美, 张全芳, 王文良, 李广贤, 杨连群,, 朱文银*, 周学标*

1.山东省水稻研究所, 济南 250100； 2.山东省农业科学院生物技术研究中心, 济南 250100； 3.山东省种子管理总站, 济南 250100

稻瘟病亦称稻热病，是由子囊菌(Magnoporthegrisea(Hebert)Barr)引起的世界性病害[1]。利用抗稻瘟病基因培育抗稻瘟病品种是防治稻瘟病最为经济高效的方法。发掘利用抗稻瘟病基因，利用分子辅助选择培育抗稻瘟病的水稻品种，是防治稻瘟病的基本策略之一[2]。利用抗稻瘟病基因位点的功能分子标记鉴定选育品种的稻瘟病抗性基因的分布对利用分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻品种具有重要意义。

20世纪60年代中期，日本率先开展了水稻品种抗稻瘟病基因分析的研究工作，鉴定了最初的8个抗性位点上的14个基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析的鉴别体系[3]。随后，国际水稻研究所和中国等产稻国也逐渐开展了水稻稻瘟病抗性遗传的系统性研究。截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点,共84个主效基因[4]。这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有染色体上(2个隐性，其他显性)。其中Pb1、Pi-a、Pi-b、Pi-ta、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi9、Pi21等24个基因已被成功克隆[4]，为抗稻瘟病分子标记辅助育种奠定了基础。Pi-ta基因位于水稻第12染色体靠近着丝点附近的区域，定位于BAC克隆BAC142E8上。Pi-ta基因包含2个外显子和1个1 463bp 的内含子，编码1个长度为928个氨基酸的细胞质膜受体蛋白。该蛋白含NBS结构域和富亮氨酸结构域(LRD)，Pi-ta位点上的抗感两基因的编码产物仅有1个氨基酸的差异，即第918位氨基酸由抗病产物的丙氨酸变异为感病产物的丝氨酸，其抗病机制是Pi-ta基因的编码产物能与稻瘟病菌的无毒基因AVR-Pita表达产物相互作用引发抗病反应[5]。Pi-ta在粳稻中表现出持久稳定的稻瘟病抗性，被广泛用于稻瘟病抗性育种[6]。Pi-b来源于水稻品种BL1，位于水稻第2染色体长臂近末端，与RFLP标记RZ123、C379、C2782B 等连锁。Pi-b基因属于“NBS-LRR”类抗病基因，Pi-b编码1个由1 251个氨基酸组成的蛋白产物，该产物包含1个核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)和17个富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats, LRRs)，其中，氨基端的NBS 区存在激酶1a、2a和3a 结构域单位，LRRs 中部有8个成簇的半胱氨酸残基[7]。利用抗稻瘟病基因Pi-b自身序列及其等位的感病基因序列建立的分子标记，可有效地用于分子标记辅助选择[8]。

Pi54(最初命名为Pi-kh)定位于水稻第11染色体上，是Pi-k基因座上的一个重要基因，对稻瘟病菌具有广谱抗性[9]。Sharma等[10]克隆了Pi54基因，在抗病品种Tetep中，Pi54 仅包含1个外显子，编码1个由330氨基酸组成的NBS-LRR类抗病蛋白。Pikm是稻瘟病抗性位点Pik上的一个主效抗病等位基因。Pikm定位于水稻第11 染色体长臂近末端区域，并被精细定位在BAC克隆OSJNBa0036K13的84 kb区间内[11]。Pikm是由两个紧密连锁的具有独立功能NBS-LRR类基因(Pikm1-TS和Pikm2-TS)组成，Pikm1-TS和Pikm2-TS的编码产物均是NBS-LRR 类抗病蛋白，长度分别为1 143个氨基酸和1 021个氨基酸[12]。张羽等[13]利用Pikm的分子标记对陕西省部分水稻材料进行了检测，明确了Pikm抗性基因在陕西水稻育种中的利用情况，并对抗性基因型类别与抗性关系进行了初步探讨。范方军等[14]对2012年江苏省迟熟中粳稻预试64份品系进行了基因检测，解析了稻瘟病抗病基因Pi-b、Pi-ta、Pikm和Pi54在江苏省粳稻稻瘟病抗性育种中的作用。

稻瘟病是山东稻区的主要病害，但稻瘟病抗性基因在山东水稻品种的分布及利用研究较少[15,16]。本研究利用稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pikm的基因功能标记，对2016年山东省区试品系及连云港联合体区试材料进行检测，结合稻瘟病抗性接种鉴定，对抗病基因与品种的稻瘟病抗性的关系进行了初步分析，以期为山东及黄淮区抗稻瘟病育种研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种48份，包括2016年山东省水稻区试品种32份，其中中晚熟组区试品种21份，编号W1601～W1611、W1622～W1631；机插秧组区试品种11份，编号J1601～J1611；连云港科企水稻育种联合体区试品种16份，编号GA-1～GA-8、GB-2～GB-9。以丽江新团黑谷为感病对照。

1.2 稻瘟病基因功能标记检测

DNA提取及PCR检测参考范方军等[14]的方法。根据等位基因特异PCR原理，针对Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pikm抗感等位基因序列差异设计引物(表1)。利用Pi-ta引物检测到1 042 bp片段，同时Npi-ta引物扩增不出目的片段，这样的材料含有Pi-ta基因[17]；利用Pi-b引物检测到365 bp片段，同时Npi-b引物扩增不出目的片段，这样的材料含有Pi-b基因，而Pi-b不能扩增出目的片段，但是Npi-b引物可扩增803 bp片段，携带有等位感病基因[18]；抗病基因Pi54功能标记为共显性标记，扩增片段216 bp(抗)/359 bp(感)[19]。抗病基因Pikm由2对引物扩增，Pikm1引物扩增片段大小为174 bp(抗)/213 bp (感)，Pikm2引物扩增片段大小为290 bp(抗)/332 bp(感)，2对引物同时扩增出抗病目的片段，表明存在抗病基因Pikm[12]。

表1 用于PCR检测的引物序列及扩增片段长度Table 1 Sequences and amplified fragment size of primers used for PCR.

1.3 稻瘟病抗性鉴定

稻瘟病抗性鉴定由天津市植物保护研究所进行。稻瘟病菌为2015年在水稻典型病株上分离的强致病性菌株，共计7个生理小种，包括天津市优势稳定生理小种ZB17、ZC3、ZG1，以及江苏省4个生理小种ZB21、ZC5、ZD5、ZF1。然后通过高粱粒扩大培养，获得含有大量分生孢子的病原菌接种体。采用人工接种和自然诱发相结合的方法进行鉴定。4月13日将鉴定材料用菌虫清药液浸种处理48 h，捞出用清水冲洗两遍，表面凉干播种。4月15日播种，撒播，苗瘟在苗床鉴定，叶瘟和穗颈瘟插秧后鉴定。调查和评价方法参照国家水稻区试方案和《水稻抗主要病虫害评价标准》执行。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病抗性基因检测结果

利用水稻稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54 和Pikm的功能标记检测2016 年山东省33份区试材料及连云港育种联合体16份材料(图1，表2)。结果表明鲁资稻7号、袁策19号、鲁资稻8号等15个品种含有抗稻瘟病基因Pi-ta；YS-6-6、润农9号、晶稻180等25个品种含有抗稻瘟病基因Pi-b；YS-6-6、晶稻180、圣稻053等26个品种含有Pi54基因；YS-6-6、圣稻053、济稻1号等22个品种含有Pikm基因。其中鲁资稻7号含有Pi-ta、Pi-b、Pi54 和Pikm4个抗性基因，YS-6-6、济稻1号、D400等13个品种含有3个抗性基因。晶稻180、大粮303、圣稻053等20个品种携带2个抗性基因。临稻10号、丰稻2号、天和糯303、TD-301、徐稻3号、临稻21、圣稻052、隆粳21不含有Pi-ta、Pi-b、Pi54 和Pikm的抗病等位基因。

图1 引物Pita、Npita、Pib、Npib、Pi54、Pikm1、Pikm2在不同品种中的扩增结果Fig.1 The result of PCR using functional marker of Pita, Npita, Pib, Npib, Pi54, Pikm1 and Pikm2 in different varieties.注:M:DL2000；1～24：临稻10号、YS-6-6、润农9号、晶稻180、圣稻053、济稻1号、丰稻2号、大粮303、鲁资稻7号、D400、临13-10、天和糯303、TD-301、圣糯1号、H11-15、济稻4号、垦育88、圣012、袁策19号、圣稻504、鲁资稻8号、圣稻14、晶稻160、圣稻177。

编号品种名抗性基因分子标记检测Pi-taPi-bPi54Pikm稻瘟病抗性综合评价综合指数损失率最高级抗性等级W1601临稻10号SSSS5．15MSW1602YS-6-6SRRR5．47MSW1603润农9号SRSS7．69HSW1604晶稻180SRRS6．37SW1605圣稻053SSRR4．33MSW1606济稻1号SRRR2．83MRW1607丰稻2号SSSS5．17MSW1608大粮303SSRR4．53MSW1609鲁资稻7号RRRR53MSW1610D400SRRR4．53MSW1611临13-105SRRS7．39SW1622天和糯303SSSS5．57MSW1623TD-301SSSS5．47MSW1624圣糯1号SRSS5．59MSW1625H11-15SRRS7．67HSW1626济稻4号SRRR4．43MSW1627垦育88SRRR4．53MSW1628圣012SSRR4．33MSW1629袁策19号RSSR4．43MSW1630圣稻504SSRS7．37SW1631鲁资稻8号RRSR6．17SJ1601圣稻14SRRR5．57MSJ1602晶稻160SSRS6．37SJ1603圣稻177SSRR4．35MSJ1604D0610RRSS7．19SJ1605润农14SRRR7．47SJ1606圣稻072SRRR3．11MRJ1607临13-110SRSR4．13MSJ1608济T040SSRR4．43MSJ1609润农11RRSS5．15MSJ1610圣稻1647RRSR4．13MSJ1611大粮302RRSS5．43MSGA-1徐稻3号SSSS4．35MSGA-2连粳14JD24RRRR43MRGA-3泗2333RSSS43MRGA-4徐41368SSSR4．53MSGA-5淮258RRRS6．37SGA-6盐稻1075RSSS6．15SGA-7扬粳128RRSS7．59S

注：抗性基因分子标记检测结果中：S：感病基因型；R：抗病基因型；稻瘟病抗性综合评价结果中：S：感病；R：抗病；HS:高感；MS：中感；MR：中抗。

2.2 供试品种稻瘟病抗性鉴定

如表2所示，48份品种中，济稻1号、圣稻072、连粳14JD24、泗2333 4个品种表现中抗(MR)；临稻10、YS-6-6、圣稻053、徐稻3号等26个品种表现中感(MS)；晶稻180、临13-105、圣稻504等15个品种表现感病(S)；H11-15、润农9号、晶稻160 3个品种表现高感(HS)。

2.3 供试水稻品种稻瘟病抗性与抗病基因的相关性分析

利用抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pikm的功能标记检测试验材料。结果表明，48个品种可分为16种基因型(表3)。临稻10号、丰稻2号、天和糯303等8个品种不含有这4个抗性等位基因，其中临稻10号、丰稻2号、天和糯303等7个品种表现为中感，圣稻052表现为感病。泗2333、盐稻1075只携带抗性基因Pi-ta，抗病鉴定分别为中抗和感病；圣糯1号、润农9号只携带抗病基因Pi-b，分别表现为中感和高感；3个品种只携带抗病基因Pi54，2个表现为感病，1个表现为高感；徐41368只检测到抗病基因Pikm，表现为感病；含有2 个抗病基因Pi-ta和Pi-b的材料有4个，2份表现为中感，2份表现为感病；郑稻20、新稻89含有Pi-ta和Pi54 2个抗病基因，表现为中感；袁策19含有Pi-ta和Pikm，表现为中感；含有Pi-b和Pi54的材料有4份，3份表现为感病，1份表现为高感；含有Pi-b和Pikm的材料有2个，1份表现为中感，1份表现为感病；含有Pi54和Pikm的材料有5个，表现为中感；淮258含有抗病基因Pi-ta、Pi-b和Pi54，表现为感病；含有抗病基因Pi-ta、Pi-b和Pikm的材料有3个，1份表现为中抗，1份表现为中感，1份表现为感病；含有Pi-ta、Pi54和Pikm的材料有1个，表现为感病；含有抗病基因Pi-b、Pi54和Pikm的材料有8个，2份表现为中抗，5份表现为中感，1份表现为感病；鲁资稻7号、连粳14ZD24含有Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pikm4个抗性基因，表现为中感。

相关性分析表明(表4)，抗稻瘟病基因Pikm与穗颈瘟发病率、穗颈瘟损失率、稻瘟病综合指数、损失率最高级存在显著相关性(相关系数分别为0.6164、0.4401、0.5156、0.4775、0.4563，P<0.01)。本研究中，其他3个基因与稻瘟病抗性表型间的相关性不显著。

表3 供试材料抗病基因的分布及抗病性表现Table 3 The genotype combination and their resistance for blast of test materials.

注：MR:中抗；MS:中感；S:感病；HS:高感。

表4 供试材料抗病基因的分布与稻瘟病抗性的相关性分析Table 4 Correlation analysis between the genes and disease reactions of plant materials in this study.

注：*表示相关性达显著水平(P<0.05)。

3 讨论

随着水稻抗稻瘟病基因的定位、克隆及分子标记的发展，对基于抗稻瘟病基因碱基序列的标记进行筛选，大大提高了抗病基因鉴定及育种选择的效率，分子标记辅助育种已成为抗病育种的一种简单快捷的途径。改良水稻品种的抗性，育种家首先要清楚品种携带的抗病基因，并进行抗性品种的合理布局。何重等[20]进行了江苏部分粳稻品种和品系中稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的基因型分析，明确了Pi-ta和Pi-b在江苏省部分粳稻中的分布。时克等[21]利用Pi-ta和Pi-b基因的特异性分子标记，结合稻瘟病菌接种鉴定，检测和分析了我国58份水稻主栽品种(杂交稻亲本)的Pi-ta和Pi-b抗性基因型。范方军等[14]对江苏水稻品种进行了稻瘟病基因的分子标记检测，结果表明Pi-b、Pi-ta、Pikm和Pi54是江苏省粳稻育种中重要的抗病基因，其中抗稻瘟病基因Pi-ta与穗颈瘟抗性存在显著相关性。王军等[22]利用分子标记辅助选择进行了水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b和Stv-bi的聚合，提高了抗病育种效率。本文研究结果表明，Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm在山东及黄淮区新选育品种中分布频率较高，其中Pi-b、Pi54、Pikm的分布频率超过或接近50%(限于本文供试品种)，Pi-ta分布频度相对较低，这4个抗性基因已在山东及黄淮区抗稻瘟病育种中得到广泛应用，其中Pikm与稻瘟病抗性存在显著相关。

本文只研究了Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm在部分山东及黄淮区新选育品种中的分布情况，例如临稻10号、丰稻2号、天和糯303、临稻21、徐稻3号等8个品种不含以上4个抗性等位基因，对稻瘟病也存在一定抗性，表明可能含有其他稻瘟病抗性基因(如Pi5、Piz-t、Pi2等)，对于其他抗稻瘟病基因的分布利用情况有待进一步研究[23～25]。

由于稻瘟菌的毒性易发生变异和新小种的产生，通常抗病品种在推广3～5 年后就丧失了抗性。因此发掘广谱抗性基因，提高水稻对稻瘟菌的持久广谱抗性，一直以来都是水稻抗稻瘟病育种工作的重点。稻瘟病的防治应该充分利用遗传多样性方法，在不同地区间和年度间种植不同类型的抗瘟品种，使抗性基因合理布局和轮换使用，以避免品种抗性和抗性基因的丧失，延长抗性品种的使用年限。近年来我国育种家在水稻抗稻瘟病育种领域取得了较大进展，Deng等[26]成功克隆了持久广谱抗稻瘟病基因Pigm，并揭示了水稻广谱抗病与产量平衡的表观调控新机制。Li等[27]通过大数据分析与遗传、生化、病理等实验方法和技术手段相结合，挖掘了对稻瘟病的新型广谱高抗的水稻遗传资源，阐明了新型广谱持久抗病的分子机理，为稻瘟病广谱抗病育种提供了理论和应用基础。后续研究应继续加强广谱抗稻瘟病基因资源的发掘与利用。

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