罗氏核酸检测试剂在无锡血站的应用分析

胡越，高犁，蒋瑞馨

(无锡市中心血站检验科，江苏 无锡 214021)

HBV、HCV和HIV等传染病的经血传播一直是影响输血安全的关键因素。根据国家《献血者健康检查要求》的规定，血站必须对献血者血液标本进行乙肝表面抗原、丙肝抗体和艾滋病抗体酶免检测。这虽然大大降低了经血传播疾病的风险，但由于酶免检测存在较长的“窗口期”，仍无法完全避免输血传播疾病的发生[1]。而且有部分处于乙肝隐匿性感染状态下的献血者献血，这是常规酶免检测方法无法筛查出来的[2]。近年来，具有高敏感度、高特异性的核酸扩增检测技术（NAT）在部分发达国家的献血者筛查中得到应用，极大地缩短了乙肝表面抗原、丙肝抗体和艾滋病抗体检测的“窗口期”，因酶免检测漏检而导致的输血后病毒感染显著减少[3]。为摸索适合本站实际情况的核酸扩增检测方案，笔者对本站129299份酶免检测合格的献血者血液标本使用美国罗氏诊断公司核酸联合检测试剂盒进行核酸扩增检测，以分析罗氏MPX试剂在无锡地区献血者筛查中应用情况。

1 材料与方法

1．1 标本来源 2013年4月至2016年5月本站酶免检测合格的献血者血液标本129299人份。

1．2 仪器 STAR全自动加样系统、FAME酶免处理系统、哈密尔顿全自动混样仪、罗氏核酸提取仪、罗氏核酸扩增检测仪、DL-5M低温离心机。

1．3 试剂 美国罗氏诊断公司乙肝、丙肝、人类免疫缺陷病毒（1+2）NAT检测试剂盒（Cobas Taq-Screen MPX）。北京万泰生物药业公司，厦门英科新创科技公司，北京科卫生物科技公司乙肝、丙肝、人类免疫缺陷病毒ELISA检测试剂盒。

1．4 方法 献血者采血结束后留取3管血液标本（2支用于酶免等常规检测；1支用于核酸扩增检测）。血液采集后按要求及时离心，4℃冰箱保存。第二日先进行酶免检测，检测结果为阴性的血液标本则进行核酸扩增检测。用哈密尔顿全自动混样仪、罗氏核酸提取、扩增与检测仪对血液标本进行混样和检测。每6份血液标本分别吸取167μl进行汇集后用于合并检测核酸。每批检测均设置一个阴性对照和三个阳性对照，每个归集混样管均含有内标对照（IC）。阴性对照不能检测到扩增信号，而阳性对照和内标对照能检测到的扩增信号应符合试剂盒要求，否则本批实验结果均为无效结果。若1个归集混样管的检测结果为阴性，则该归集混样管中的6个标本均为阴性；若1个归集混样管的检测结果为阳性，则需要对该归集混样管中的6个标本做单独拆分检测，根据单个标本检测结果来判定为NAT阳性或者NAT阴性。

将判定为NAT阳性的血液标本冷冻保存，统一送江苏省血液中心作确认实验和定量分析，对乙肝NAT阳性的血液标本用化学发光免疫检测系统做乙肝“两对半”检测。对酶免检测阴性、核酸扩增检测阳性的献血者进行追踪，采集血液标本进行重复酶免检测和核酸扩增检测。

2 结果

对酶免检测为阴性的129299人份血液标本进行核酸扩增检测，共检测出HBV DNA阳性129例，HCV RNA阳性1例，HIV RNA阳性1例。对129例HBV DNA阳性血液进行HBV荧光定量检测，共发现65例病毒拷贝数＜20IU/ml，16例病毒拷贝数＞50IU/ml，剩余48例定量试验呈阴性。81例HBV DNA阳性标本经化学发光法检测有73例为乙肝e抗体(HBeAb)和核心抗体(HBcAb)阳性。对7例HBV DNA阳性献血者于献血30d后采集血样进行检测，仍然为HBsAg阴性，HBV DNA阳性。HCV RNA阳性血液首次病毒定量为 4．27×106IU/ml，32d后本血站对该名献血员采血复查，抗-HCV ELISA检测为阳性，核酸检测均有反应性，核酸定量检测病毒载量为 4．68×103IU/ml。 对 1例 HIV RNA阳性献血者首次和随访两次检测结果见表1。

3 讨论

核酸扩增检测技术在我国献血者血液筛查方面的优势日益明显。研究表明隐匿性乙肝感染者与处于乙肝血清标志物转阳前（窗口期）的献血者是造成乙肝表面抗原酶免检测后仍然导致输血感染乙肝的主要原因[2]，处于“窗口期”的献血者的乙肝血清标志物会随时间延长而转为阳性，而隐匿性乙肝感染者的乙肝血清标志物一般不会转为阳性[4]。实验结果中81例HBV DNA阳性标本经化学发光法检测有73例为乙肝e抗体(HBeAb)和核心抗体(HBcAb)阳性，判断其为乙肝病毒携带者或乙肝感染恢复期。对7例HBV DNA阳性献血者于献血30d后采集血样进行检测，仍然为HBsAg阴性，HBV DNA阳性，符合隐匿型乙肝感染（OBI）的表现。

窗口期一般是指从人体被病毒感染到人体外周血能检测出该病毒标志物的这段时间，如进口酶免试剂做乙肝表面抗原、丙肝抗体和艾滋病抗体检测的平均“窗口期”分别为 46d、71d、23d[5]，混样核酸扩增检测可将HBV、HCV和HIV检测的 “窗口期”缩短到23d、58d和12d[6]。根据对HCV RNA阳性献血者和HIV RNA阳性献血者的追踪检测，证实这分别是1例处于HCV感染 “窗口期”和1例处于HIV感染“窗口期”的献血者。尽管核酸扩增检测只能缩短检测感染的“窗口期”，但处在核酸检测“窗口期”的血液传染性极低，不少研究均表明核酸扩增检测与酶免检测的检测结果有互补之效，可降低因酶免检测漏检而产生的输血后病毒感染几率，显著提高输血安全性[7-9]。根据本人的核酸检测结果证明，美国罗氏诊断公司核酸联合检测试剂盒应用于献血者血液筛查后，能在酶免检测阴性的血液标本中进一步筛查出乙肝、丙肝和艾滋病核酸阳性的献血者标本，避免了临床患者因输血而感染乙肝、丙肝和艾滋病的不良事件，产生了良好的社会效益。

核酸扩增检测技术可以忽略个体间的免疫应答差异，能较早检测出样本中含量极低的病毒核酸成分，大大缩短检测的“窗口期”，它与酶免检测的原理和方法各不相同，所以将两者结合在一起用于血液检测，先进行酶免检测去除阳性标本，再进行核酸检测，不仅降低了核酸检测工作量，而且消除了阳性标本易引起污染的影响因素[10]。同时核酸扩增检测又有别于传统的酶免血清学检测，实验操作不当极易造成假阳性和假阴性，它对标本处理方式、检验操作规程、室内质控、实验室设备和布局等问题有着更为严格的要求，这些问题还有待进一步的探讨。

[1]Allain JP，Hewitt PE，TedderRS，et al．Evidence that anti-HBc but not HBV DNA testing may prevent some HBV transmission by transfusion[J]．Br J Haematol，1999，107(1)：186-195．

[2]Allain JP．Occult hepatitis B virus infection：implications in transfusion[J]．Vox Sang，2004，86(2)：83-91．

[3]王讯．采供血机构开展血液病毒核酸检测的条件及意义[J]．中国输血杂志，2008，21(11)：825-826．

[4]Levicnik SS，Rahne PU，Allain JP，et al．Anti-HBs positive occult hepatitis B virus carrier blood infectious in two transfusion recipients[J]．J Hepatol，2008，48(6)：1022-1025．

[5]Roth WK．NAT and viral safety in blood transfusion[J]．Vox Sang，2000，78(Suppl 2)：257．

[6]任芙蓉．核酸检测技术在国内外血液筛查中应用[J]．北京医学，2008，30(8)：561-564．

[7]谢云峥，陈凌燕，蔡茵，等．核酸检测技术在上海地区血液筛查中的初步应用[J]．中国输血杂志，2011，24(9)：764-766．

[8]王良华，叶贤林，尚桂芳，等．免疫筛查阴性献血者血样病毒核酸检测的研究[J]．中国输血杂志，2005，18(4)：286-289．

[9]刘德春，孙波，徐群，等．核酸检测技术与酶联免疫检测技术在血液筛查中的初步应用比较[J]．中国输血杂志，2007，20(1)：43-45．

[10]赵红娜，王艺芳，葛文超，等．郑州地区无偿献血者中核酸检测的初步应用[J]．中国输血杂志，2014，27(9)：923-926．