纳米羟基磷灰石复合人工骨材料的研究进展*

乔军杰安帅*程宏飞孙义高

骨移植材料能对临床常见的骨坏死、肿瘤、骨质疏松、外伤、感染等多种原因导致的骨缺损进行填充、提供支持进而加速骨缺损愈合。自体骨是临床最理想的移植材料，但其应用常受到供区局部组织损伤、疼痛、骨量有限等的限制。近年来，材料科学、组织工程学和纳米技术等学科的快速发展与渗透催生了多种复合人工骨材料的研发，合成人工骨、组织工程骨的研究与应用已取得突破性进展[1]。

羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是天然骨的无机组分，植入体内可与正常骨组织直接连接而无修复过程中的纤维组织界面形成[2]，并且对成骨细胞的黏附、增殖及细胞外基质分泌有促进作用；同时在体内能够进行生物降解[3]。以羟基磷灰石为基础组分所构建的复合材料可基本满足现有骨组织工程人工骨的条件，但其抗剪切及弯曲能力较弱[4]，现有研究表明，合成HA的特性与其直径大小密切相关，粒径介于1 nm～100 nm的羟基磷灰石晶体与普通HA颗粒相比具有众多优势：如高表面积、与自然骨的化学相似性、比普通HA拥有更高的溶解度和更高的生物活性等[5]，以nHA为基础组分，复合生物高分子材料构建的支架材料显示出众多优点：力学性能逐渐衰减，能匹配新骨形成中所需的渐变的力学环境，对缺损部位能提供良好的力学支撑，复合的生物高分子多具有直接或间接的调节局部微环境，加速骨生成的作用；同时可改变材料的孔径及孔隙率以更好的吸附生物活性因子或种子细胞等，因此，复合纳米羟基磷灰石（Nano-hydroxyapatite,nHA）材料的研究主要集中于对 HA力学性能的改进及通过单相或多相复合使其形成具备一定特殊性能的人工骨。本文主要针对以nHA为基础组分构建的复合人工骨的研究现状与应用作一综述，并对未来的研究方向进行展望。

1 纳米羟基磷灰石支架材料

自然骨由纳米低结晶的磷灰石、微量碳酸钙及胶原纤维组合形成特殊的空间结构。胶原具有可降解性和低抗原性，从仿生的角度看，nHA与胶原复合能很好的模拟自然骨的状态，因此，胶原被广泛应用于构建骨组织工程支架材料[6]。

Hatakeyama等[7]利用所制备的nHA/猪I型胶原复合物进行人成骨细胞体外培养，研究发现细胞在材料上黏附状态良好，表型维持稳定，同时碱性磷酸酶（ALP，alkaline phosphatase）、骨钙蛋白（OC，osteocalcin）等的表达明显增加，且表达量随培养时间而逐渐升高。Kikuchi等[8]在兔胫骨节段性缺损模型修复中发现胶原/nHA复合材料可与骨组织形成键性结合，材料被破骨细胞逐渐吸收，新骨的形成过程中，无任何毒性、炎症等不良反应发生，该研究进一步发现，胶原/nHA复合材料与骨改建代谢中产生的新生骨间形成的交联可以改变材料本身的力学强度和在体内的吸收过程，并在维持复合材料的强度和形状中起到关键性作用。

目前研究认为以胶原及nHA为基质构建的人工骨最接近正常骨组织的结构与性能，但是胶原力学性能相对较差的特点使复合结构难以长期维持，这限制了其在人工骨领域的应用[9]，所以如何提高二者复合后的力学强度将是未来研究的主要方向。

聚乳酸（Polylactic acid,PLA）被美国FDA批准为生物降解性医用材料，是一种具有良好生物相容性和生物降解特性的聚合物，成为当前仿生细胞外基质中最受重视的生物材料之一[10]，具有较好的机械强度、弹性模量和热成型性。将nHA与PLA复合可以获得特定的微观结构，延缓PLA在体内的降解速率并增加材料韧性与组织相容性[11]。Lee等[12]将人骨髓干细胞（bone marrow stem cell，BMSC）培养于nHA/PLA复合材料，发现该材料能诱导BMSC增殖并上调ALP及OC的表达，有明显的促进钙离子矿化作用，从而达到修复骨缺损的目的，因此能满足作为细胞或细胞因子等载体材料的要求。nHA/PLA复合后材料的弹性模量得到明显提高，其在体内抗拉伸、压缩性能较 nHA单独应用更佳，同时其内搭载的hMSC也能够进行良好的增殖和分化[13]。尽管复合材料中PLA降解速率减缓，但仍与成骨速度不相匹配，难以进行有效的控制，可能导致材料崩塌，使缺损局部失去力学支撑。针对这一问题，PLA/nHA复合人工骨的研究应更着重于其力学性能的控制。

壳聚糖（chitosan，CS）具有生物相容性、生物降解性和抗菌性，是自然界迄今为止发现的膳食纤维中唯一带正电荷的动物纤维，因其成孔能力及与负离子的结合能力优越[14]，引起了人们对于CS/HA复合材料的深入研究。体外研究中 nHA-壳聚糖支架材料已经被多项研究证实能诱导MSCs增殖与黏附，促进其成骨分化，同时成骨标志物如 I型胶原、Runx-2（Runt-related transcription factor 2）、ALP、OC等的表达明显上调[15]。对Palazzo等[16]制备的CS/nHA骨软骨替代材料的研究发现，该材料具有良好的孔径结构、孔隙率、骨与软骨间连接良好，材料可由破骨细胞吸收而进行生物降解。Fan等[17]在 nHA/CS复合材料中搭载淫羊藿，可明显促进BMSC的增殖和分化。近年来不断有研究[18]证实壳聚糖与nHA的复合物在药物缓释的过程中发挥重要的作用，因此以提升所载药物缓释性能为目的，以壳聚糖、纳米羟基磷灰石为基础组分的多相复合人工骨可能会成为未来研究的热点方向。

此外，较常见的高分子支架材料尚有明胶、聚乳酸/乙醇酸共聚物 (PLGA)、聚酰胺（PA，polyamide）等，研究表明：在适宜的温度条件下，明胶中富含的羧酸根负离子与HA中的Ca2+可形成丰富的化学键结合，这种结合在明胶与nHA的自组装和生成的过程中发挥了重要作用[19]。因此nHA/明胶复合物有望成为骨组织工程材料的研发新方向。Ji等[20]针对HA明胶复合材料的不同形态对诱导骨再生能力的研究发现，球面的复合材料相较于棒状材料在体内外研究中展示了更好的诱导成骨分化和骨形成能力。朱超等[21]报道羟基磷灰石胶原海藻酸钠（Alg/nHAC）可以通过聚集诸如骨诱导蛋白等来影响细胞的黏附、增殖和分化并进一步促进成骨。Li等[22]报道，将nHA与PLGA静电纺丝纳米纤维等复合，明显增加了成骨细胞的黏附、迁移、增殖以及骨祖细胞的成骨分化能力。此外该材料能明显减少局部炎症的发生，刚好可以弥补单独使用PLGA时所造成的的局限。聚酰胺分子中含有极性酰胺键这一特性可使其与nHA间的结合更加紧密。近来已有学者发表采用类似合成材料在人体内的研究结果，Xiong等[23]利用化学发泡法制得的nHA/PA66复合材料，在兔胫骨缺损模型中证实材料无毒性、无致敏效应，同时可促进缺损骨加速愈合，置入人体5年后回顾性研究发现，置入该材料后伤口愈合良好，无任何不良反应，该材料与人体在平均6月后形成坚固的骨性融合，1.5年左右完全与宿主骨组织融合。

总之，以纳米羟基磷灰石为基础组分，复合高分子生物材料构建的支架搭载种子细胞、生物活性因子等所构建的人工骨在体内外实验中被证实能明显促进骨形成，但其只是最大限度的去模拟自然骨组织，并不具备自然骨的全部性能，因此有学者建议应用两种或两种以上物质进行多相复合[24]，以形成全方位性能更佳或具备某一特定优势的人工骨。

2 载药nHA复合人工骨

复合人工骨材料可靶向释放药物，因而降低了全身高血药浓度所带来的副作用，并提高了所载药物的生物利用度。利用这一特性，负载特殊作用药物的复合人工骨材料被不断研发。目前研究主要集中于抗菌类、抗肿瘤类、抗骨质疏松类、载生物活性因子等羟基磷灰石复合人工骨。

2.1 抗菌nHA复合人工骨

在诸如急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎等的治疗中，即使在病灶清除术后局部细菌仍有一定的几率存活，因此治疗中需要维持局部有效抗生素浓度，而传统的大剂量长时间全身应用抗生素往往会造成细菌耐药性，严重者可导致全身多个器官发生药物性损伤。

负载抗菌类药物的人工骨可在感染骨组织局部形成较高的抗生素浓度，同时也可对骨缺损部位进行填充提供力学支撑。多种负载抗菌药物的人工骨材料，已经被证实具有显著的抗菌效应[25]。现有具有抗菌效应的nHA复合人工骨负载的抗菌物质主要可分为抗生素与金属离子。

2.1.1 载抗生素人工骨材料

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现，使得目前骨感染的临床治疗难度明显加大。目前MRSA已成为外科系统院内感染的主要致病菌，而MRAS对万古霉素非常敏感。Huang等[26]研究nHA/CS/魔芋甘聚糖/万古霉素复合材料在治疗金黄色葡萄球菌感染的兔胫骨缺损时发现，载抗生素组无明显感染，炎性指标正常，同时可见缺损局部骨小梁的形成，表明该复合材料抗菌效果明显。纳米羟基磷灰石作为药物载体时，会不可避免的产生所载药物前期突释现象，这就导致抗菌药物难以在局部形成长期稳定的药物浓度，使其应用在一定程度上受到限制。有研究表明[27]，载有四环素的HA复合材料，前6天可释放79.8%的药物总量，这对纳米羟基磷灰石人工骨药物缓释系统及抗生素剂量提出了更高的要求，因此新型人工骨应最大限度的将局部药物浓度控制在较稳定的水平，并且寻求最佳的药物浓度尽可能的减少药物对成骨细胞带来的影响。近年来，人们将研究侧重于对羟基磷灰石进行多相复合来调节药物缓释效应。许多高分子材料如PLA、PGA、CS等，在体内可逐步降解且对所载药物的性质影响甚微，而药物则能在其构建的支架系统中能进行缓慢释放。Venkatasubbu等[28]研究发现环丙沙星/海藻酸钠/nHA与环丙沙星/nHA相比，前者具有明显的缓释效应。由此可见，复合材料中不同组分会对药物的缓释产生重要的影响，因此，在保证抗菌性能的基础上，可选择性对人工骨材料进行多相复合以维持药物的稳定性释放。

2.1.2 载金属离子人工骨材料

部分重金属离子具备杀菌能力，金属离子的加入可以使复合材料更具有韧性，能够接受更多的剪切应力。目前用于制备人工骨材料的金属离子有银、锌、铜等[29]。Ag+可通过破坏胞膜蛋白质而损伤细胞膜，也可以干扰细菌DNA合成等达到灭菌的效果[30]，Ag+因其抑菌范围广、抑菌性强、本身毒性低、化学性质稳定的特点而广受青睐。体外研究中，Nath S等[31]通过烧结法构建的10wt%Ag+、HA的复合物与单纯HA相比并不影响细胞增殖及细胞间黏附能力，而骨矿物沉积率更高。Saravanan等[32]通过冷冻干燥法制得CS/nHA/Ag+复合材料，在体外针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌行抑菌实验，结果显示载Ag+组抑菌效果明显，进一步研究显示实验组材料可对Ag+进行缓释控制，且该过程与新生骨组织长入大致相匹配。但载金属离子的复合材料在体内应用研究较少，仍处于进一步的研究与探索中，重金属离子的不当应用会对机体产生严重的毒副作用，同时不当的加工过程也会污染环境，因此，未来针对该种材料的改进应主要集中于金属离子的种类、剂量等，此外局部缓释及材料的加工过程也应有更好的认识与研究。

2.2 抗肿瘤nHA复合人工骨

对于骨肿瘤患者，病灶切除会造成局部骨组织缺损，术后全身化疗药物的应用因药物严重的毒副作用，可导致全身肝、肾等重要脏器损害，负载抗肿瘤药物的人工骨因其全身血药浓度较低，同时化疗药物局部高浓度更有利于杀灭肿瘤细胞，理论上可以较好解决肿瘤术后骨缺损及进一步的抗肿瘤治疗。近年来不断有报道认为纳米羟基磷灰石本身具有一定的抗肿瘤效应，分析其原理[3]可能为：HA改变胞膜的通透性致其钙离子过多摄入进而出现肿瘤细胞钙超载；影响肿瘤细胞核酸的合成，诱导细胞周期阻滞促进肿瘤凋亡；降低肿瘤细胞的端粒酶的水平。Kamitakahara等[33]结合HA自身抗肿瘤效应及针对骨肿瘤的热疗，成功构建了HA球形多孔支架材料，内置磁性纳米粒子在骨肿瘤缺损局部交变磁场中可产生高温进而杀灭术后残存的癌细胞。然而该材料也有相应的缺点，由于局部产生高温，因此不可避免的会损伤正常骨组织，因此需对所施加交变磁场的强度以及内部磁性纳米粒子的量进行更为精确的调控。Andronescu等[34]通过冷冻干燥法制得的胶原-羟基磷灰石/顺铂人工骨材料在体外实验中被证实对 G292骨肉瘤细胞有明确的细胞毒性，并可明显抑制肿瘤细胞再生并降低其侵袭能力，是一种针对骨肿瘤可行的局部化疗载药人工骨系统，但其研究缺乏进一步的体内研究，尚无法证明该种材料是否能够促进肿瘤局部新骨生成，或对周围正常组织有无干扰作用。

2.3 抗骨质疏松nHA复合人工骨

此外，也有研究将复合羟基磷灰石材料用于治疗骨质疏松。Shi等[35]在PLGA/HA中载入阿仑膦酸钠，研究证实该复合材料中阿伦磷酸钠缓释良好，并明显上调ALP的水平并增加了成骨细胞增殖。Asahina等[36]构建的RIS/ZnHA复合材料能有效的提升大鼠绝经后骨质疏松的骨量，并且进一步证明该种复合材料较RIS单独治疗OP更具有优势。

3 载生物活性因子nHA复合人工骨

骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein,BMP)是一种存在于骨基质中的酸性多肽类物质，可以诱导骨髓基质干细胞及未分化的间充质细胞（mesenchymalstem cell，MSC）向成软骨细胞和骨细胞转化。BMP已被成功用于骨折、骨延迟愈合以及骨缺损的治疗。因此，BMP与支架材料进行复合便具有既能填充缺损局部进行力学支撑，又能加速骨愈合的优势。Asahina等[35]制备得到HA/BMP复合物，动物实验初步表明该材料骨诱导活性比单纯羟基磷灰石和HA/胶原复合材料都要高。此外，Lee等[37]证实利用纳米羟基磷灰石作为支架材料，能对BMP等的缓释有更好的控制。Hannink等[38]构建了不同载BMP缓释模型并比较了TCP/HACol+BMP与TCP/HAHep+BMP两种材料之间的异同，分析认为前者能更好的控制BMP的缓释，直到3周时仍有BMP释放，而后者在2周的时候BMP已经全部释放。值得提出的是，与载抗生素人工骨相似，载生物活性因子时采用何种支架材料能尽可能的减少对所载因子的作用的干扰以及控制释放过程仍值得进一步的研究与探索。

总之，虽然针对nHA复合人工骨的研究已取得突破性的进展，但现有材料仍存在许多问题：如材料的降解速率与成骨速度不相协调，部分合成的HA的表面活性相对较差而影响负载种子细胞成活及细胞因子的黏附、分布，此外不少材料仍会引起机体炎性反应等。

随着组织工程学、材料科学、分子生物工程技术等的发展及各学科间的渗透、协作，复合人工骨材料的研究必然将迎来更迅猛的发展。未来针对纳米羟基磷灰石复合人工骨的研究可能集中于以下几个方面：通过对HA孔隙率及孔径大小等的控制改善基质材料的生物力学性能和物理特性；着重于人工骨材料的生物相容性，加强nHA与生物活性物质的亲和力；着重所载药物缓释的缓释控制，优化复合材料的降解速率，使其与成骨速度相匹配；寻求生物活性物质的最优选择与及各物质间的最佳搭配等。

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