蓖麻毒蛋白在细胞内的转运过程研究进展

徐雅楠,孙立杰,于丽丽,黄凤兰

蓖麻毒蛋白在细胞内的转运过程研究进展

徐雅楠1,2,孙立杰1,于丽丽1,黄凤兰1,2

1. 内蒙古民族大学生命科学学院, 内蒙古 通辽 028000 2. 内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心, 内蒙古 通辽 028000

蓖麻毒蛋白（Ricin）是一种核糖体失活蛋白，对真核细胞有毒性。它移除真核细胞核糖体大亚基28S rRNA保守序列中特异的腺嘌呤残基，使蛋白合成过程终止，导致细胞死亡。本文对蓖麻毒蛋白在植物细胞内合成后转运出细胞的过程，以及蓖麻毒蛋白作用于哺乳动物细胞时转运过程的研究进展予以简要描述。

蓖麻毒蛋白; 转运过程; 蓖麻细胞; 哺乳动物细胞

蓖麻毒蛋白（Ricin）是主要存在于蓖麻（）种子中的一种植物糖蛋白，含量占籽重1%~5%。蓖麻作为油料作物，全球广泛种植。作为蓖麻油产业的副产物，蓖麻毒蛋白每年产量50000 t[1]。蓖麻毒蛋白是核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating Protein，RIP）家族成员，可使核糖体失活而终止蛋白合成，对真核细胞具有毒害作用。蓖麻毒蛋白对酵母菌的毒性相比于对哺乳动物细胞的毒性较弱，对某些恶性肿瘤细胞毒性更强[2]。这使它在医学上成为用于杀伤肿瘤细胞的首选毒素之一。蓖麻毒蛋白属于B级生物威胁制剂，至今仍无可用疫苗，且因其毒性大、易提取的特点，易为恐怖组织利用成为生物武器。针对其毒性的治疗策略相关研究围绕着酶活性抑制、毒素摄取或运输的干扰等方面进行。研究蓖麻毒素疫苗或治疗手段仍停留在小鼠、灵长类等动物实验阶段[3,4]。蓖麻毒蛋白的毒性既可以成为肿瘤治疗的一剂良药，也可以作为毒药低剂量致死。所以，为更好的防治并利用蓖麻毒蛋白，它的毒性作用机理成为研究的重点。研究的目的是更深入的理解作用机理，并对疫苗的研发以及进一步抗癌治疗奠定基础。

1 蓖麻毒蛋白的毒性机制及生物学功能

蓖麻毒蛋白在种子的发育阶段合成并储存在成熟蓖麻种子的液泡中。蓖麻毒蛋白是一种异二聚体，具有催化活性的A链（Ricin toxin A，RTA）和具有细胞识别功能的B链（Ricin toxin binding subunit B，RTB）通过二硫键连接在一起。

RTA是其活性亚基，分子量约为32 kDa，是267个氨基酸残基组成的球形糖蛋白，在10和236位天冬氨酸残基上进行糖基化[5,6]。RTA糖基化不影响其催化能力，而是刺激毒素运出内质网[8]。通过一系列研究发现，RTA亚基的糖基化以及RTA的C-末端疏水序列有助于其转运出内质网进入细胞胞液并发挥毒性。RTA具有糖苷酶活性，可以从真核细胞核糖体大亚基的28S rRNA移除保守序列中特异的腺嘌呤残基（A4324）[8]，阻止翻译延伸因子eEF-2结合到核糖体的GTP酶活性中心，加速细胞死亡。在RTA与核糖体相互作用时，需要P1/P2蛋白辅助[9]，与P蛋白的结合是与核糖体相互作用的关键步骤[10]。RTA与蓖麻毒蛋白全毒素毒性有很大的差异，RTA因其缺乏RTB影响了进入细胞的效率，所以只有轻微毒性[3]。

RTB是结合亚基，分子量约为34 kDa，是由262个氨基酸残基组成的哑铃型蛋白质，有两个主要的结构域，每个结构域上都含有一个半乳糖结合位点。RTB具有凝集素活性，是半乳糖结合蛋白，能与细胞表面的半乳糖/N-乙酰半乳糖胺残基结合[11]，通过由受体介导的内吞方式进入细胞。

蓖麻毒蛋白家族有6~8个成员[12,13]。其中两个主要的成员是蓖麻凝集素II（Ricinus communis agglutinin ll，ricin）和蓖麻凝集素I（Ricinus communis agglutinin l，RCA）。储存的蛋白在种子萌发后的几天内被水解，用以提供种子发育过程中基因表达产生的编码蛋白合成所需的氨基酸。种子萌发后的几天内，随着植株光合合成能力的增强，储备的蛋白质被完全消耗掉，此时的蛋白合成可以通过光合合成来完成。因此，蓖麻毒蛋白的生物学功能一方面是种子的储存蛋白，同时用以种子自我防御，防止食草动物啃食。

2 蓖麻毒蛋白在植物细胞中合成后的运输过程

蓖麻的基因组由10条染色体组成。调查结果显示：基因组中具有28个推定的Ricin基因，包括潜在的假基因和基因片段，但是其中只有一个应答于蓖麻油的生物合成，说明种子产生高毒性蛋白有选择压力[14]。

蓖麻毒蛋白在蓖麻细胞内先合成一条含有RTA和RTB序列的多肽链前体，这一前体包含576个氨基酸残基。多肽链N-末端的35个氨基酸残基包含一段26个残基组成的N-末端信号序列和一段9个残基组成的前导肽[15]。后面紧跟着267个氨基酸残基的RTA序列，12个氨基酸残基组成的连接肽，以及262个残基组成的RTB序列。12个氨基酸残基的连接肽包含了引导蓖麻毒蛋白进入液泡的目标序列[16]。

在植物细胞内合成蓖麻毒蛋白的过程中，N-末端信号肽指导初始多肽链转运是通过内质网膜进入到内质网腔，使9个残基的前肽在N-末端暴露出来。在信号肽被切除后，RTA的N-末端的9个残基的前肽作为间隔区影响通过内质网膜的共翻译转运和蛋白核心糖基化的效率[17]。内质网腔中新合成的前肽缺少了26个残基的信号肽，但仍包含N-末端前导肽和12个残基的连接肽。这种需要剪切-转位-激活的结构特征对于产生毒素的植物细胞的自我保护非常重要，因为植物细胞本身的核糖体对于RTA的作用也十分敏感。前肽中的RTA部分不具有催化活性，与B链的连接抑制了A链的催化活性。这种抑制作用是由毒蛋白前肽中RTB通过空间位阻效应妨碍了RTA活性位点的暴露。事实上，这种对于RTA活性位点的抑制作用也存在于RTA:RTB偶联的成熟的异二聚体中[18]。正是在蓖麻毒蛋白产生和运输过程中的这种隐藏活性位点的无活性形式阻止了蓖麻细胞内自身核糖体的失活。

蓖麻毒蛋白产生和运输过程中，在植物细胞内质网膜上的转运过程伴随着蛋白前体三次主要的修饰过程。首先，N-末端信号序列（26个氨基酸残基）被内质网腔信号肽酶剪切（Co-translationally）。然后，蓖麻毒蛋白前体（Proricin）进入内质网腔后被N-糖基化修饰。蓖麻毒蛋白前体有四个N-糖基化位点，两个位于RTA序列，两个位于RTB中。最后，蛋白二硫化异构酶催化蛋白内五个二硫键的形成。在成熟的蓖麻毒蛋白中，四个二硫键在RTB中，另一个二硫键连接着RTA和RTB[19]。

蓖麻毒蛋白需要从植物细胞的合成位点通过内质网运输至液泡中储存。糖基化的前肽通过运输泡从内质网通过高尔基体复合物运输进入液泡。连接的多糖在胞内运输过程中被修饰结合。12个氨基酸残基的连接序列还包含了液泡分选信号。到达液泡后，前肽被内肽酶剪切加工去除RTA和RTB之间的12个氨基酸残基的连接序列以及前肽N-末端的9个氨基酸残基[20]。液泡加工酶（VPE）负责剪切前肽中C-末端的天冬氨酸残基。前肽加工终止于天冬氨酸的剪切。这类蛋白水解作用是典型的种子储存蛋白的成熟过程[21]。RTA和RTB仍然通过一个二硫键共价连接，RTA和RTB中间连接序列的剪切是在二硫键中间发生的。

3 蓖麻毒蛋白在哺乳动物细胞中的转运

蓖麻毒蛋白在植物细胞中是顺向运输，最终进入液泡并形成具有活性的成熟形式。而在作用于哺乳动物细胞时，蓖麻毒蛋白通过RTB亚基与细胞表面的受体结合，通过内吞作用进入哺乳动物细胞，并有一部分释放自由的RTA并最终输送到胞液，与核糖体相互作用。逆向运输通路[22]是从高尔基体反面网络（Trans-Golgi network，TGN）到内质网的运输过程。蓖麻毒蛋白就是采用此通路（其他毒素从内质网进入靶细胞胞液）进入内质网腔。就蓖麻毒蛋白而言，现在对于运输通路中的很多分子细节还是不清楚的。

3.1 蓖麻毒蛋白进入哺乳动物细胞的内吞过程

蓖麻毒蛋白与其他生物毒素类似，都是通过与细胞表面受体结合而内吞进入细胞内部的。细胞表面的某些成分无意中充当了毒素进入细胞的受体。蓖麻毒蛋白RTB亚基作为一个半乳糖特异性凝集素，潜在的细胞表面靶标是暴露在外的-1，4-半乳糖残基。这样的组分在哺乳动物细胞表面数量丰富（例如，Hela细胞含有3×107潜在的结合位点）[23]。

细胞表面结合的蓖麻毒蛋白一部分通过内吞作用进入细胞内部。蓖麻毒蛋白进入细胞后最先出现在早期内吞泡（Early endosomes，EEs）。从早期内吞泡开始，毒蛋白可能有几种不同的命运。一部分蓖麻毒蛋白从早期内吞泡通过晚期内吞泡进入溶酶体，被酶解降解。一部分蓖麻毒蛋白从早期内吞泡进入回收内吞泡，并返回细胞表面，完成一个无用的进出循环。小部分蓖麻毒蛋白从早期内吞泡进入到TGN中，这部分是对于细胞毒性的关键[24]。在运输过程中，RTA还必须成功通过内质网的质量控制检测过程——内质网相关的蛋白降解（ER-associated protein degradation，ERAD），才能最终从内质网腔进入胞液[25]。RTA的泛素化是其被蛋白酶体降解的关键特征。多泛素链通常添加到赖氨酸残基上。而从内质网进入到胞液的RTA具有低赖氨酸特征，所以首次提出RTA的低赖氨酸特征是其能够逃过ERAD检测从内质网进入胞液的主要原因[26]。实验证实，额外引入赖氨酸残基会增加RTA被蛋白酶降解的倾向。

3.2 蓖麻毒蛋白运输进入内质网的运输过程

在真核细胞中，内质网是分泌蛋白和细胞器各类膜蛋白的通路入口。新生蛋白通过内质网膜上的Sec61转位子进入内质网腔[27]。在内质网腔中，这些新合成的蛋白质折叠、成熟并加工依赖于内质网中的分子伴侣和内质网内催化N-糖基化及二硫键形成相关的酶。寡聚蛋白从单体成分依次装配。以上这些过程都受到内质网质控系统（ER quality control，ERQC）的监督[28]。新合成的蛋白在通过ERQC后才能进一步在内质网发挥功能或是通过囊泡转运出内质网分泌出细胞。而未能正确折叠或是组装的蛋白质将被ERAD识别并进一步处理掉，因为非正常蛋白在细胞内积累会对细胞产生伤害。那么对于像RTA这样一个天然的蛋白质如何才能被ERAD识别成为其底物而不运出内质网？答案似乎是RTA在内质网中的部分折叠。RTA的C-末端包含一个疏水性肽段。在全毒素中，这一疏水区域被RTB所覆盖。而当RTA从全毒素中被释放后，这一疏水区域暴露并与内质网相互作用。以上现象是间接通过RTA与脂质体作用后构象展开证明的[29]。而后，又进一步了解到RTA与内质网膜相互作用是通过与磷脂酰丝氨酸相互作用[30]。提纯的RTA也是热力学不稳定的，易于聚集或形成熔球体[31]。以上过程偶联内质网膜的嵌入过程，使得RTA进一步展开部分构象。推测，这种膜嵌入形式可以模仿一个错误折叠的蛋白，可以使RTA以ERAD通路从ER逃离。在脱位前，ERAD底物必须维持可溶形式，这可能是BIP共分子伴侣的需求[32]。还发现，ERAD特异性的甘露糖苷酶调节蓖麻毒性[33]。

一旦蓖麻毒蛋白的全毒素进入内质网腔后，RTA必须释放并以具有潜在催化活性的形式进行反向转运（ER到细胞胞液）。在内质网的氧化环境中，RTA和RTB的分离是在二硫键异构酶催化下完成的还原反应[34]。RTA运出内质网必须成功逃离ERAD。

3.3 蓖麻毒蛋白在细胞质内的分类过程

泛素化是蛋白酶降解蛋白质的选择的关键特征。泛素链常被修饰到赖氨酸残基侧链上。蓖麻毒蛋白中RTA低赖氨酸含量这一特征使得一部分RTA有机会逃离泛素降解的命运而发挥其毒性作用。所以，从这个角度更容易理解蛋白酶体抑制剂可以增加哺乳动物细胞对蓖麻毒蛋白的敏感性这一现象[26]。RTA从内质网运出后从RTP4转移给相邻的RPT5亚基。随后，RTA在RPT5分子伴侣功能以及Hsc70的协助下恢复其催化活性[35]。现在，RTA在胞液中失活的机制还不清楚，蛋白酶体不能直接将RTA作为有效底物水解。HOP（Hsc70-Hsp90 operating protein）介导的从Hsc70转移到Hsp90-CHIP E3复合物可能指导RTA进入蛋白酶体[31]。

4 总结与展望

在蓖麻细胞的合成过程中，蓖麻毒蛋白从内质网，到高尔基体再到液泡采取顺向转运。在蓖麻细胞转运过程中，要保证蓖麻毒蛋白不与细胞内自身核糖体发生作用，影响蛋白合成。而当它毒害哺乳动物细胞时，毒蛋白经历了从细胞表面到内质网的逆向转运过程，并进一步转运进入胞液后发挥其毒性作用。因此，蓖麻毒蛋白从合成后到进入靶细胞发挥作用这整个过程是个复杂过程，要依赖于毒蛋白的有效合成及运出，也依赖于细胞表面的可用受体，成功进入内质网后，全毒素的分离以及与内质网内分子伴侣的相互作用，并RTA脱位转运出内质网。在这一系列有趣又不寻常的过程中还隐藏着很多未知的问题有待被发现。而这些过程的详细研究解将为蓖麻毒蛋白中毒治疗以及其毒性在肿瘤治疗中的应用奠定基础。

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Research Progress of Ricin Transport Process in Cells

XU Ya-nan1,2, SUN Li-jie1, YU Li-li1, HUANG Feng-lan1,2

1./028000,2.028000,

Ricin is a ribosome-inactivating protein (RIP) that is highly toxic to eukaryotic cells. It removes the specific adenine residues from the 28s rRNA conserved sequence of the eukaryotic ribosomal large subunit, thus terminating the process of protein synthesis and leading to cell death. In this paper, the process of ricin synthesized and transported out of plant cells and the progress of ricin transported into mammalian cells are briefly described.

Ricin; transport process; castor cell; mammalian cell

Q71

A

1000-2324(2018)06-0916-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.06.002

2017-05-05

2017-7-25

内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心开放基金(MDK2016004)

徐雅楠(1984-),女,理学博士,从事生物大分子相互作用动力学研究. E-mail:yanan_0609@163.com