主动脉夹层患者高密度脂蛋白亚类功能变化研究

王振坤,李鹏,聂炳荣,刘辰,何婧

主动脉夹层在急性期致残率及死亡率高，是一种灾难性血管性疾病。目前对于主动脉夹层的病因和发病机制仍不明确，普遍认为主动脉夹层是多种因素的共同作用而发病。有研究表明近50%以上的主动脉夹层患者合并有血脂异常[1]。高密度脂蛋白（HDL）是血脂中重要一员，其亚类主要由HDL2及HDL3组成，具有促进胆固醇逆转运、抗氧化、抗炎等多种功能，与高血压、动脉粥样硬化关系密切，同时高血压、动脉粥样硬化均是主动脉夹层的重要病因，而对于HDL同主动脉夹层之间是否存在联系目前尚少见报道。为此，本研究通过检测主动脉夹层患者HDL亚类各功能即促进胆固醇逆转运（RCT）功能[测巨噬细胞[3H]胆固醇转出率]、抗氧化功能[测对氧磷脂酶1（PON1）活性]、抗炎功能[测细胞间黏附分子1（ICAM-1）及血管内细胞黏附因子1（IVCAM-1）]，以明确主动脉夹层患者其HDL亚类功能变化情况，为主动脉夹层的预防及治疗提供一个可能新的方向。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2013-01至-2015-01我院确诊的急性主动脉夹层患者60例作为主动脉夹层组，其中男性44例，女性16例，年龄26～64岁；健康体检者60例患者作为健康对照组，其中男性38例，女性22例，年龄25～60岁。

1.2 诊断标准

急性主动脉夹层诊断标准：根据临床表现，如急性胸痛合或背痛，经增强计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）检查显示主动脉内膜撕裂将主动脉夹层分为真假两腔，即可确诊。

1.3 血脂测定

晨起空腹抽取肘静脉血2 ml，置于普通生化采血管中，静置30 min 后离心取血清，置于-70 ℃冰箱保存备用。采用酶法在全自动生化仪上测定血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）。

1.4 HDL亚类（HDL2及HDL3）测定

参照文献[2]方法。1.06 mol/l MnCl2·4H2O溶于蒸馏水，加水至终体积1 L，后将490 mg肝素钠盐溶于2 ml蒸馏水，取1.5 ml溶液溶入上述25 ml溶液中配成肝素/ MnCl2溶液。3 ml血浆中加入0.3 ml肝素/ MnCl2混匀，室温下放置15 min左右。以1 500 g在4℃下离心1 h，取出部分透明上层清液进行总HDL测定，并进行下一步操作。1.43 g硫酸右旋糖酐溶于0.15 mol/L NaCl中，并用0.15 mol/L Nacl加至100 ml配成硫酸右旋糖酐溶液。在2 ml上层清液中加入0.2 ml硫酸右旋糖酐溶液，混匀，室温下放置20 min。以1 500 g在4℃下离心30 min，取出部分透明上清液进行HDL3测定。HDL2浓度则等于总HDL减去HDL3浓度。

1.5 [3H]胆固醇转出率的测定

参照文献[3，4]方法，将J774巨噬细胞接种在24孔细胞培养板上，以DMEM/F12 培养液（含0.2%BSA，细胞浓度2×105个/ml）于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养，同时在培养液中分别加入[3H]胆固醇（1 μCi/ml）及氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL，30 μg/ml）促进细胞对[3H]胆固醇的吸收，培养24 h后去除培养基并以DMEM/F12 培养液洗涤1次后，再次加入DMEM/F12全培养液、环磷酸腺苷（cAMP，0.3 mmol/L）培养 12 h 后，加入 apoA1（10 μg /ml）4 h以促进[3H]胆固醇转出，细胞用PBS平衡盐溶液洗涤并用NaOH（0.1 mol）完全溶解，最后利用液闪计数仪检测细胞溶解物及细胞介质的[3H]放射量。[3H]胆固醇转出率用细胞介质中[3H]胆固醇放射量占总放射量（细胞内＋细胞介质）的百分比表示。

1.6 血清对PON1活性测定

根据Tang等[5]的方法。1.3 ml反应缓冲液（2 mmol/L CaCl2， 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），加入 5 mmol/L的乙酸苯酯150 μl，于25℃预温20 min后，加入用缓冲液稀释到1：10的血清50 μl（稀释液为反应缓冲液），反应90 s。分光光度计于270 nm波长测定吸光度值。酶活性计算公式如下：PON1活性=A×f×FV×103/（t×SV×L×ε）。A为净吸光度值（即标本吸光度-血清对照和底物对照的吸光度值），f为标本稀释倍数，FV为反应终体积，t为反应时间，SV为样品体积，L为光径，ε为摩尔消光系数。

1.7 ICAM-1及IVCAM-1的测定

将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）种入细胞培养板（细胞浓度5×105cells/ml），培养箱培养12 h，而后加入健康体检者、主动脉夹层患者的HDL（1 mg/ml），孵育4 h后加入肿瘤坏死因子α（10 ng/ml），刺激4 h后中止反应，抗人CD54-PE和 CD106-FITC单克隆抗体标记后，流式细胞仪检测平均荧光强度获得 ICAM-1和IVCAM-1的表达水平。1.8 统计学方法采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，计量资料 以±s表示，组间比较采用t检验，计数资料以构成比表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者基线资料比较（表1）

两组受试者年龄、TC、TG、LDL-C、HDL-C差异无统计学意义（P均＞0.05）；主动脉夹层组血压水平高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 两组受试者基线资料比较（±s）

表1 两组受试者基线资料比较（±s）

注：与健康对照组比较aP＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

项目健康对照组(n=60)主动脉夹层组(n=60)年龄 (岁) 52.2±10.5 51.8±9.8甘油三酯 (mmol/L) 1.55±0.78 1.42±0.49总胆固醇 (mmol/L) 4.89±0.66 5.03±0.76低密度脂蛋白胆固醇 (mmol/L) 3.19±0.75 3.33±0.81高密度脂蛋白胆固醇 (mmol/L) 1.42±0.30 1.34±0.43收缩压(mmHg) 114.09±11.60 154.17±10.36a舒张压(mmHg) 69.86±7.52 89.49±9.19a

2.2 两组受试者血浆HDL2及HDL3比较

与健康对照组相比，主动脉夹层组HDL2水平 降 低 [（41.15±19.02） mmol/L vs（60.48±22.19）mmol/L ，P=0.010]，HDL3 水平升高 [（58.85±29.97）mmol/L vs（39.52±30.15） mmol/L ，P=0.013]，差异均有统计学意义。

2.3 两组受试者HDL亚类介导的巨噬细胞[3H]胆固醇转出率比较

主动脉夹层组巨噬细胞[3H]胆固醇转出率（5.79±0.97）%低于健康对照组（11.45±2.15）%，差异具有统计学意义（P＜0. 01）。

2.4 两组受试者PON1活性比较

主动脉夹层组PON1活性（125.62±9.90）μ/ml低于健康对照组（158.72±13.27）μ/ml，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.5 两组受试者HUVEC表达ICAM-1及IVCAM-1的平均荧光强度比较

与健康对照组相比，主动脉夹层组ICAM-1平均荧光强度 [（33 571.85±2 529.97）vs（17 239.52±4 330.15）]及 IVCAM-1平均荧光强度[（442.15±119.02）vs（260.48±92.19]均较高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

主动脉夹层是一种病情凶险、进展快、死亡率高的疾病。主动脉夹层始发于主动脉壁内膜和中层撕裂形成内膜撕裂口，主动脉腔内血液经内膜撕裂口直接穿透病变中层，将中层分离成夹层。目前其发病机制尚未十分明确，现公认的危险因素有高血压、动脉粥样硬化（AS）、炎症性疾病、基因遗传性疾病、医源性损伤、妊娠等[6，7]。对于血脂与主动脉夹层的关系目前尚未有定论，有研究认为血脂高者，主动脉夹层发生率低，而血脂过度降低易发生主动脉夹层，理由是胆固醇是合成动脉中层平滑肌细胞（SMC）膜必需成分；甘油三酯分解产物游离脂肪酸（FFA）是肌细胞的能源供应体，所以当脂质缺乏时则SMC代谢失控，代谢产物堆积，弹力纤维发生变性或坏死，主动脉壁易受损，易导致主动脉夹层生成。但本研究显示主动脉夹层患者血脂同健康对照组相比较无明显差异，提示单纯的各血脂浓度可能并不能完全揭示与主动脉夹层的关系，各血脂成分其功能变化也许比其浓度变化更重要。

HDL-C是血脂重要成分，具有保护心血管的作用，是抗AS和冠心病的一个独立因素，但应用升高血浆HDL-C水平的药物，如胆固醇酯转移蛋白抑制剂并不能降低心血管事件发生率，提示可能是HDL功能而不是HDL-C水平起关键作用。有研究[8]表明HDL亚类功能可独立于HDL-C水平更好地预测AS和冠心病发生风险。HDL是一个复杂的多功能蛋白复合体，其亚类主要以HDL2和HDL3为主，HDL2为大的、密度较小、成熟的颗粒，HDL3为小的、密度较大、未成熟的颗粒[9]。目前认为HDL的心血管保护作用很大程度上是由于它介导RCT[10]。HDL将胆固醇从周围组织（包括粥样斑块）转运到肝脏代谢，这一过程就称RCT，通过RCT可减少脂质在血管壁的沉积。RCT过程是HDL由小颗粒转变成大颗粒的成熟代谢过程，即preβ→HDL→HDL3→HDL2。研究表明HDL2较HDL3具有更好的心血管保护作用，但亦有部分研究提示二者具有同等程度的心血管保护作用[11，12]。本研究证实，主动脉夹层患者HDL2水平下降，HDL3水平升高，且RCT能力下降；提示主动脉夹层患者HDL亚类颗粒变小，其代谢成熟过程受阻，引起RCT减弱，导致主动脉血管壁胆固醇沉积，易致粥样斑块形成，主动脉夹层发生概率增加；同时也证实HDL2可能较HDL3具有更好的心血管保护作用。

HDL的心血管保护作用除了RCT，另外还具有抗炎、抗氧化等功能[13]，同样也发挥重要作用，而ICAM-1及IVCAM-1、PON1可准确反映HDL的抗炎、抗氧化功能。近年来国内外有基础实验和临床研究均证实了主动脉夹层发生发展过程中有炎症反应参与，部分炎症性疾病是主动脉夹层危险因素。C反应蛋白（CRP）是经典的心血管疾病预测因子，参与了炎症过程，其可诱导ICAM-1、IVCAM-1的产生，而研究发现HDL可抑制CRP诱导的内皮细胞黏附分子的表达[14]。本研究从抑制黏附分子表达证实，主动脉夹层组患者HDL抑制ICAM-1及IVCAM-1表达能力较健康对照组明显下降，表明其HDL抗炎功能减弱。PON1是HDL上的重要抗氧化酶，与高血压及动脉粥样硬化均关系密切。研究表明，敲除鼠其PON1，即使在正常血脂状态下，也会出现血管壁炎性反应增加和脂质过氧化物堆积，从而导致AS[15]。本研究显示主动脉夹层患者PON1活性下降，表明其HDL抗氧化能力减弱。

本研究的不足之处：研究未设立单纯高血压组，需深入的研究进行改进。

综上所述，本研究证实主动脉夹层患者血脂各浓度水平无明显变化，但HDL亚类功能发生明显变化，其RCT、抗炎、抗氧化功能减弱，易引起血管壁脂质沉积、炎性反应增加、脂质过氧化物堆积，可产生血压升高及动脉粥样硬化、血管壁炎性病变等多种危险因素，最终使主动脉夹层发生率升高。

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