转化生长因子-β1对慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉上皮紧密连接屏障功能的影响

矫 健 张 罗，2*

(1. 首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 教育部耳鼻咽喉头颈科学重点实验室 鼻病研究北京市重点实验室,北京 100730；2. 首都医科大学附属北京同仁医院鼻过敏科，北京 100730)

慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps， CRSwNP)是以鼻窦鼻腔黏膜的慢性炎性反应及息肉形成为主要特征的上呼吸道常见疾病，在全球人口中发病率为0.5%～4%，主要症状为鼻塞、黏性或黏脓性鼻涕、头面部胀痛、嗅觉减退或丧失等，严重影响患者的生活质量[1]。鼻息肉发病与多种因素有关，如遗传因素、免疫缺陷、纤毛功能障碍、阿司匹林耐受不良等，但发病机制至今尚不明确。

鼻黏膜上皮细胞间紧密连接(tight junction， TJ)屏障是呼吸道屏障功能的重要组成成分，主要由多种跨膜蛋白如claudin家族、occludin、tricellulin和骨架蛋白如zonula occludens(ZO)-1、ZO-2、ZO-3、cingulin组成[2-3]。其主要功能为：调控上皮细胞间的密闭性和通透性，阻止外界致病原如细菌、病毒和过敏原等进入机体；调节细胞的增生和分化；参与机体信号转导和固有免疫等[4-5]。

鼻黏膜上皮屏障功能破坏与鼻息肉发病密切相关，Soyka等[6]在西方鼻息肉患者人群中研究发现，鼻上皮屏障功能受炎性因子γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)和白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)调控。本实验室前期研究[7]也提示，在中国鼻息肉患者中，鼻黏膜中紧密连接蛋白ZO-1和claudin-1表达量降低，但是关于中国鼻息肉患者鼻上皮紧密连接功能的调控机制尚不清楚。

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)是一种具有显著免疫调节和致纤维化功能的多效性细胞因子，在免疫抑制和组织重塑中发挥重要作用。此外，TGF-β1还可在多种细胞类型中调控上皮紧密连接屏障功能如人肺上皮细胞、人支气管上皮细胞、人肠上皮细胞等[8-10]。尽管已知TGF-β1在鼻黏膜炎性反应的组织重塑中发挥重要作用，但是关于其对鼻黏膜上皮屏障功能的调控作用目前尚未有报道，本研究旨在体外培养的鼻黏膜上皮细胞(健康对照及鼻息肉来源的鼻上皮细胞)中探讨TGF-β1对上皮紧密连接屏障功能的调控作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究获首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会批准(批准文号：TRECK 2014-12)，所有受试者均已签署知情同意书。总计有10例健康对照(6例男性，4例女性，年龄20～60岁)和12例鼻息肉患者(7例男性，5例女性，年龄25～59岁)入组研究。鼻息肉组诊断符合欧洲鼻窦炎及鼻息肉诊疗指南2012年版(European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps， EPOS)及中国慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南(2012年，昆明)[1]，鼻内镜手术中留取患者鼻息肉组织。健康对照组来自接受鼻中隔校正术的单纯鼻中隔偏曲患者，不伴有其他鼻部炎性反应，手术中留取患者的中鼻甲黏膜。术前4周内局部或全身应用糖皮质激素患者除外，真菌性鼻窦炎、后鼻孔息肉、传染性疾病以及肿瘤患者除外。

引物序列为：EF1α正向引物5′-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3′, 反向引物 5′-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3′; claudin-1正向引物 5′-CAGTCAATGCCAGGTACGAATTT-3′, 反向引物 5′-AAGTAGGGCACCTCCCAGAAG-3′; claudin-4正向引物 5′-TGTACCAACTGCCTGGAGGAT-3′, 反向引物 5′-GACACCGGCACTATCACCATAA-3′; occludin正向引物5′-GATGAGCAGCCCCCCAAT-3′, 反向引物 5′-GGTGAAGGCACGTCCTGTGT-3′; ZO-1正向引物 5′-ACAGTGCCTAAAGCTATTCCTGTGA-3′, 反向引物 5′-TCGGGAATGGCTCCTTGAG-3′; ZO-2正向引物5′-CGGTTAAATACCGTGAGGCAAA-3′, 反向引物 5′-GGGAACCACTGGGTGTAATTCA-3′。

1.2 细胞培养、刺激与跨膜阻力(transepithelial resistance， TER)检测

TGF-β1刺激上皮细胞72 h后，甲醇-丙酮(50∶50)混合液固定上皮细胞，0.3%(体积分数) triton X-100 通透，5%(质量分数)脱脂奶粉封闭。部分细胞用Alexa488标记anti-occludin 抗体 (1∶100， 美国Invitrogen公司)直接染色，部分细胞用anti-ZO-1抗体(1∶200， 美国Invitrogen公司)孵育过夜后，加入Alexa488标记的二抗。DAPI复染后封片，激光共聚焦显微镜(奥林巴斯IX 81显微镜，日本)下观察。

1.3 细胞间荧光素通透性检测

1.4 免疫荧光染色

健康对照鼻黏膜及鼻息肉黏膜组织经蛋白酶消化过夜后，接种于细胞培养皿中，于人支气管上皮培养基(bronchial epithelial growth medium， BEGM)(美国Lonza公司)中常规培养，待上皮细胞扩增至80%～90%时行胰蛋白酶消化，按照1.5×105细胞/孔密度接种于人胎盘胶原预铺板的transwell双层培养皿(美国Corning公司)中开始气液界面(air-liquid interface， ALI)培养，待上层膜中细胞生长融合后，去除上层培养液，仅从基底侧给予DMEM∶BEGM(1∶1)培养基，同时培养基中添加5×10-8mol/L视黄酸，继续培养至细胞分化完全、TER达到平台期后(气液培养21 d左右)开始加药刺激。TGF-β1(1 ng/mL、10 ng/mL)(美国R & D公司)分别从基底侧给予细胞，对照组不作处理，在刺激前(0 h)、刺激后24、48、72 h分别应用TER检测仪(Millicell-ERS， 美国Millipore公司)测量上皮细胞跨膜阻力。

1.5 mRNA提取与实时荧光定量PCR检测

TGF-β1刺激上皮细胞72 h后，直接用RLT缓冲液裂解细胞，用RNeasy mini试剂盒(英国Qiagen公司)提取总RNA，提取步骤参照说明书进行。紫外分光光度计检测RNA浓度(A260/A280在1.8～2.0之间)，1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。应用QuantScript反转录试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)将1 μg RNA反转录为cDNA，-20 ℃保存。

根据UltraSYBR Mixture(With ROX)试剂盒说明，检测各基因mRNA表达情况。扩增程序：95 ℃ 10min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)×45个循环。以延长因子(elongation factor 1α，EF1α)为内参对照，以荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(Cycle threshold, Ct)计算相对表达量：相对表达量=2-△Ct，每例样品重复3次，取平均值。

健康对照来源的鼻上皮细胞间紧密连接蛋白occludin和ZO-1表达呈现连续的线性结构，而鼻息肉来源的上皮细胞间两种紧密连接蛋白表达模式受到明显破坏，紧密连接线性结构呈现分离、断裂等，而经10 ng/mL TGF-β1刺激后，无论是健康对照还是鼻息肉来源的上皮细胞间紧密连接蛋白表达模式均较加药前有明显破坏(图2A、B)。

重庆市婚管中心于2016年9月28日正式启动重庆市婚姻家庭社会工作“家和计划”特色服务项目。该项目形成了以重庆市民政局为领导，以重庆市婚姻收养登记管理中心为统筹，以重庆市质量和标准化研究院为标准导向，以各区县婚姻登记处为依托，以“社区+社工”为载体的服务团队。

1.6 统计学方法

TGF-β1刺激上皮细胞72 h后，加入荧光素FITC-葡聚糖(FITC-Dextran) (2 mg/mL)于transwell培养皿上层内，37℃培养箱孵育24 h，取下层培养液，酶标仪(ELISA reader Mithras LB940; Berthold Technologies；德国)检测FITC-Dextran的荧光强度(480 nm)。

2 结果

2.1 TGF-β1刺激对鼻上皮细胞TER和细胞间荧光素通透性的影响

在气液界面培养21d，鼻息肉来源的上皮细胞TER明显低于健康对照上皮细胞，而细胞间荧光素FITC-Dextran的通透性则明显高于对照组上皮细胞(图 1A)。10 ng/mL TGF-β1刺激上皮细胞72 h，无论是在健康对照还是鼻息肉来源的上皮细胞中，均可明显降低上皮细胞TER，同时增加细胞间FITC-Dextran通透性，而1 ng/mL TGF-β1刺激72 h，对两种来源的鼻上皮细胞TER和细胞间FITC-Dextran通透性均无明显影响(图1B、C)。

2.2 TGF-β1刺激对鼻上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响

“念到您现在所肩的责任的重大，我便连孺慕之思都不敢道及，希望您能原谅我，只要您知道我是真心敬慕您，我便够快活的了。”

“小刘和报社签订有劳动合同，她在所供职报社报纸上发的稿件，取得的收入，与其他收入一起，合并为工资薪金所得，并非新个税法中所称的稿酬所得。她投稿给其他媒体、电台的时评收入，属于稿酬所得。”济南市税务局个人所得税处负责人答复，修改后的新个税法允许劳务报酬、稿酬、特许权使用费等三类收入在扣除20%的费用后计算纳税。也就是说，按原收入额打八折计算纳税。

在静息未刺激状态下，鼻息肉来源的上皮细胞中claudin-1 mRNA表达较健康对照上皮细胞有增加趋势(图 3A)，而10 ng/mL TGF-β1刺激后，无论是健康对照还是鼻息肉来源的上皮细胞中，TJ mRNA表达水平较未刺激状态下有增高趋势，但差异无统计学意义(图 3B、C)。

在公共英语课教师潜移默化地让学生接触专业英语的同时，学校可以在低年级开设专业英语方面的选修课，让学生尽早接触专业英语，待开设专业英语课时，学生对此已不陌生，也不会将课程视为负担，从而消除畏难情绪，降低教学难度。在教学形式上，教师应考虑到课程既要教授专业英语知识，又要重视英语知识的专业性，要让学生在专业英语课上也能巩固平时所学专业知识，使专业课成绩不好的学生也能在课上获益，消除两头都学不好的顾虑。

2.3 TGF-β1刺激对鼻上皮细胞紧密连接基因表达的影响

The dissipation due to charging and discharging capacitances Edyn can be calculated as

3 讨论

鼻黏膜上皮细胞形成的紧密连接屏障是呼吸道重要的防御机制之一，既有效阻止了病原体及有害颗粒对上皮下组织的侵害，又可通过调节其对炎性反应细胞的透过性而参与炎性反应。鼻黏膜上皮屏障的破坏导致大量病原体、毒素及过敏原进入黏膜下组织，与多种疾病的发病相关，如特应性皮炎、支气管哮喘、炎性肠病等[11-12]。本研究在体外细胞培养模型中评估了中国汉族人群鼻息肉患者上皮紧密连接屏障功能的改变，发现与健康对照上皮细胞相比，鼻息肉患者上皮细胞TER明显降低，同时上皮细胞间对荧光素FITC-Dextran的通透性明显增加，说明鼻息肉患者上皮屏障功能有明显破坏，是CRSwNP发病相关因素之一。

图1 TGF-β1对人鼻上皮细胞跨膜阻力和细胞间FITC-Dextran通透性的影响。Fig.1 Effect of TGF-β1 on human nasal epithelial transepithelial resistance(TER) and paracellular FITC-dextran flux

A： Comparison of baseline TER and paracellular FITC-Dextran flux in epithelial cells from healthy control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) under resting conditions without any stimulation.*P<0.05vscontrol groups；B： Effects of TGF-β1 stimulation on TER in epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12).#P<0.05vsu.s. group；C： Effects of TGF-β1 stimulation on paracellular FITC-Dextran flux in epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP (n=12).#P<0.05vsu.s. group.TER：transepithelial resistance;u.s.:unstimulated;TGF-β1:transforming growth factor-β1;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

图2 TGF-β1对人鼻上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响Fig.2 Effect of TGF-β1 on human nasal epithelial tight junction(TJ) protein expression

Representative immunofluorescence staining for occludin(A) and ZO-1(B) in epithelial cells from healthy control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) in u.s. conditions and after 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h.Arrowspoint out stratification of TJs. Bar=20 μm;u.s.:unstimulated;TGF-β1:transforming growth factor-β1;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

图3 TGF-β1对人鼻上皮细胞紧密连接基因mRNA表达的影响Fig.3 Effects of TGF-β1 on human nasal epithelial tight junction(TJ) mRNA expression

A： comparison of TJ mRNA expression in human nasal epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) in resting conditions without any stimulation；B： effects of 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h on TJ mRNA expression in epithelial cells from control subjects(n=10)；C： effects of 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h on TJ mRNA expression in epithelial cells from patients with CRSwNP(n=12).TGF-β1:transforming growth factor-β1;u.s.:unstimulated;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

垦利油田群中某待开发油田A所产原油黏度较高，50℃下黏度为2700 mPa·s，拟采用依托周边油田开发。选取周边可能被依托开发的3个不同黏度梯队的稀油油田原油(称为稀油a、稀油b和稀油c)作为组分油。按照各油田产油量配比，分别与垦利油田A原油掺混，利用HAAKE MARS高温高压流变仪及配套温控器对混合原油进行测量，各组分油黏温特性如图1～图2所示。

鼻息肉患者具有不同的炎性表型，西方人群的鼻息肉患者多表现为Th2优势应答和嗜酸性粒细胞浸润，伴有IL-5等炎性因子升高；而亚洲人群鼻息肉患者则表现为混合性T细胞免疫反应和非嗜酸性炎性反应[13-15]。有文献[6]提示不同人种的鼻息肉患者中上皮紧密连接屏障的调控机制也有所不同，比如在高加索人群中，炎性因子IFN-γ和IL-4调控鼻息肉的屏障功能，而在澳大利亚鼻息肉患者中，Th17细胞因子在鼻黏膜屏障破坏中发挥了重要的调控作用[16]。因此，本研究探讨了中国汉族人群鼻息肉患者上皮屏障的调控机制，首次发现TGF-β1对人鼻上皮细胞紧密连接有重要的调控作用，其在健康对照及鼻息肉来源的上皮细胞上均可显著破坏上皮紧密连接，导致细胞TER降低，细胞间荧光素通透增加，破坏紧密连接蛋白表达模式，说明TGF-β1在CRSwNP屏障功能破坏中发挥了重要的调控作用，或可作为治疗干预的靶位点。

本研究结果中，在静息状态下鼻息肉来源的鼻上皮细胞TJ基因mRNA表达水平与健康对照上皮细胞相比，仅claudin-1 mRNA表达有升高趋势；而在10 ng/mL TGF-β1刺激后，TJ基因mRNA表达较未刺激前也无明显的变化，这与静息状态下息肉来源的上皮细胞TER明显低于健康对照上皮，FITC-Dextran通透性高于对照上皮；而10 ng/mL TGF-β1刺激后，两种来源的上皮细胞TER明显降低，FITC-Dextran通透性增加，TJ表达蛋白模式明显破坏结果不符。TJ相关基因在mRNA和蛋白水平表达不一致的原因尚不清楚，笔者推测是一个逆调节效应后果，但该结果也提示了CRSwNP上皮紧密连接屏障功能的非mRNA水平调控机制，具体的调控机制有待进一步的研究证实。

综上所述，本研究证实在中国汉族人群的鼻息肉患者中，鼻上皮细胞紧密连接屏障功能有明显破坏，是鼻息肉发病相关因素之一；而细胞因子TGF-β1在鼻息肉上皮紧密连接功能破坏中发挥了重要的调控作用，提示TGF-β1或可作为鼻息肉干预治疗的靶位点。

[1] 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会鼻科组. 中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组. 慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南(2012年，昆明)[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2013，48(2): 92-94.

[2] Chiba H， Osanai M， Mu