DNA甲基化改变与神经管缺陷关系研究进展

黄芸 林珊珊 任爱国

神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)的病因非常复杂，一般认为是遗传、环境或二者的交互作用引起[1]。尽管国内外研究机构投入了大量的精力，运用了各种研究手段试图寻找与NTDs发生相关的基因突变，但迄今为止，没有任何一个基因突变能够很好解释人群NTDs发生风险，更无法用于个体风险预测和疾病筛查。

另一方面，表观遗传调控与NTDs的发生日趋受到重视[2]。表观遗传指在DNA序列不变的情况下，基因的表达发生了可遗传的改变[3]。表观遗传调控可受物理、化学、生物等环境因素的影响，因此是研究基因与环境交互作用的窗口。DNA甲基化(DNA methylation)作为表观遗传调控的重要机制之一，与NTDs的发生有着复杂的联系[4]。

一、特异基因甲基化与胚胎神经管发育

DNA甲基化是指经DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases,DNMTs)的催化，将S腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine,SAM)提供的甲基添加在DNA分子上，此过程常发生在胞嘧啶-磷酸二酯键-尿嘧啶(CpG)双核苷的胞嘧啶环C5上[5]。在哺乳动物中，主要有维持甲基化与建立甲基化作用的两类DNA甲基转移酶。前者已知有Dnmt1，其通过识别DNA上的半甲基化位点，使新合成的DNA链保持既定的甲基化水平。后者包括Dnmt3a与Dnmt3b，他们在未甲基化的基因上建立新的甲基化模式[6]。作为重要的表观遗传调控形式，DNA甲基化往往与基因表达负相关[7]。

在哺乳动物胚胎发育过程中，DNA甲基化的动态调节对胚胎神经管形成起至关重要的作用。Pax3基因在脊椎动物的神经管、神经嵴及体节表达，是参与神经管形成的众多基因中最为重要的基因之一，Pax3表达抑制可导致鼠胚NTDs的形成[8]。以小鼠为例，在胚胎发育早期，Pax3调控原件本呈高甲基化。在小鼠胚胎期8.5 d时，Pax3启动子甲基化水平降低，Pax3开始在神经上皮表达，稍后表达于体节，且伴随着Pax3的表达，神经管开始形成。此时，胚胎若受到体内/外环境刺激，如氧化应激，可导致Pax3启动子持续高甲基化，最终因Pax3表达抑制诱导NTDs的形成[9]。

二、DNA甲基化改变与NTDs

为研究DNA甲基化与NTDs发生的关联，许多研究在人群或动物模型中探索全基因组或某一特定位点甲基化水平。涉及的基因主要包括叶酸代谢相关基因与生长发育相关基因。

国内一项病例对照研究发现[10]，NTDs患儿脑组织全基因组甲基化显著低于对照组，DNA甲基化水平低于4.35%者，其患NTDs的风险是对照的5.736倍；依亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因型进行分组，发现基因型为T/T的NTDs病例表现出显著的低甲基化。在荷兰的病例对照研究中观察到MTHFR低甲基化(-0.33%)与NTDs发生相关联[11]。而加拿大的一项研究[12]则得出不同的结果，该研究收集了37例NTDs患儿与19例对照，分别检测其MTHFR及全基因组DNA甲基化水平；结果发现，NTDs病例与对照间总体甲基化水平并无差异，与NTDs患者有广泛DNA甲基化水平改变的假设不符，作者推测可能与加拿大实施面粉叶酸强化，极少出现个体叶酸缺乏的情况有关。

包括Hedgehog(Hh)通路及Wnt通路等在内的胚胎发育相关基因位点亦受到广泛关注。SHH基因过度激活可能导致NTDs的发生，PTCH1作为SHH的负向调节因子，对哺乳动物神经管的发育起到重要作用。检测187例NTDs患者及212例对照样本PTCH1基因单核苷酸多态性与甲基化情况，发现该位点为c.3944C>T且呈高甲基化者患NTDs风险降低[13]。检测甲氨蝶呤诱导的NTDs胎鼠神经组织，发现其DNA总体甲基化水平显著低于对照组；随后对132个DNA甲基化异常位点进行微阵列分析，发现Wnt通路中的Siah1b与Prkx位点甲基化程度降低，表达上调；这提示在叶酸代谢障碍的个体中，DNA低甲基化可能是NTDs发生的危险因素，Wnt通路中的Siah1b与Prkx基因可能是NTDs的候选基因[14]。HOX基因在时空水平上调节着神经管的发育，针对HOX基因的甲基化检测发现，HOXB7的低甲基化是NTDs的危险因素[15]。SOX基因编码了调控胚胎发育的转录因子，对细胞分化方向有重要影响[16]。提取脊髓脊膜膨出人群白细胞DNA，发现45个基因的75个CpG位点与NTD的发生有关；进一步检测发现，仅SOX18基因出现显著的整体低甲基化；在HEK细胞中诱导SOX18去甲基化，可使SOX18低甲基化并出现表达上调；将SOX18 mRNA注入斑马鱼中，可导致其NTDs的发生[17]。

以往神经管缺陷研究中较少关注的一些因子，其甲基化状态也被报道与NTDs有关。国内一团队通过检测NTDs患儿及对照脑组织[18-19]，发现IGF2/Igf2调控元件DMR0高甲基化可增加NTDs患病风险 (OR=5.375)；随后，该团队检测了NTDs及对照胎儿脊髓组织IGF2/Igf2转录水平及其DMRs甲基化水平，发现NTDs患儿IGF2/Igf2表达水平较对照上调6.41倍，但IGF2/Igf2 DMR0甲基化水平无显著改变；在维甲酸诱导的NTDs胎鼠模型中，IGF2/Igf2表达较对照升高1.84倍，而IGF2/Igf2启动子区仅出现染色质结构松散化改变。在脊柱裂患儿的胎盘组织中，发现印迹基因GANS与三基序蛋白TRIM26的转录调节区呈现低甲基化，GNAS与TRIM26蛋白水平也相应升高，这提示胎盘组织某些基因的表观遗传状态对胚胎NTDs的形成有一定影响[20]。长散布元件(LINE-1)是人体中唯一具有自主转座能力的转座子，即LINE-1可在染色体内或不同染色体间改变相对位置，调控其他基因表达。有研究报道，胎儿神经组中LINE-1低甲基化与NTDs发病有关联[21]。为进一步研究人LINE-1(L1Hs)甲基化异常的组织特异性与神经管缺陷的关联，该团队分别检测了源于三个胚层的胎儿组织，胎盘与母体外周血L1Hs位点甲基化水平，结果发现，母体外周血甲基化水平最高(64.95%)，胎盘最低(26.82%)；L1Hs低甲基化仅在患NTDs的胎儿脑部发现，尤其是女性胎儿；在女性胎儿中，还可观察到L1Hs转录产物水平升高；以上可能与L1Hs异常低甲基化导致的染色体亲和性改变有关[22]。AKT2参与细胞增殖及血管生成因子在体外的分泌，使用基因芯片分析130例NTDs患儿及152例健康胎儿的胎盘组织DNA甲基化水平，发现在病例组中，AKT2基因甲基化升高，同时基因的表达显著降低，提示AKT2表观遗传改变与NTDs发病有关[23]。

三、一碳单位代谢因子、DNA甲基化与NTDs

一碳单位代谢异常引起的NTDs可能与甲基化异常有关[24-25]。围受孕期叶酸摄入偏低与TFAP2A基因高甲基化及表达下调有关，提示DNA甲基化改变可能是围受孕期叶酸缺乏导致胎儿NTDs发病的机制之一[26]。体内叶酸浓度与DNA甲基化水平相关，叶酸缺乏可导致全基因组低甲基化，且该现象是可逆的，通过增补叶酸，降低的甲基化可重新升高[27]。目前普遍认为，以上现象源于叶酸的甲基供体角色。叶酸在一碳单位代谢过程中起到至关重要的作用，其在蛋氨酸循环中为同型半胱氨酸(Hcy)提供甲基，生成的蛋氨酸随后与ATP作用生成甲基供体—SAM。SAM可在甲基转移酶的催化下将甲基转移至DNA分子上，完成DNA的甲基化。因此，在叶酸缺乏的情况下可造成DNA的低甲基化[28]。除了叶酸，其他参与一碳单位代谢的因子也可影响DNA的甲基化。HOX基因在补充叶酸或维生素B12后表达增强[29]。脐带血LINE-1甲基化水平与孕妇血清Hcy水平呈负相关，但与孕妇血清叶酸水平及叶酸摄入量无显著关联。提示孕妇体内叶酸代谢中间物水平可对其后代甲基化产生影响[30]。

由于叶酸是一碳单位供体，因此目前研究假设多为叶酸(暴露)水平与DNA甲基化呈正相关。但值得注意的是，与假设相反，部分人群研究表明DNA甲基化与叶酸水平并不呈正相关。有研究采用回顾性问卷调查法获得母亲叶酸摄入情况，并检测343例健康新生儿血样DNA甲基化水平，发现叶酸摄入水平与基因组DNA甲基化呈负相关[26]。一项运用欧洲新生儿队列分析母亲血浆叶酸水平与胎儿脐带血DNA甲基化关系的研究[31]，共发现了443个与母亲血浆叶酸水平有关联的GpC位点；但是，只有27个(6%)位点的甲基化水平随血浆叶酸浓度的增加而升高，而绝大多数(94%)位点的甲基化水平反而随血浆叶酸水平的增加而降低。这与一碳单位供给增加，甲基化水平升高的假设不一致。究其原因可能有三：(1)考虑到研究对象多为叶酸充足人群，认为可能存在叶酸阈值，即当体内叶酸高于特定界值，DNA甲基化水平与叶酸间关系可能不表现为正相关；(2)由于甲基化过程尚未研究透彻，可能存在未知的混杂因素；(3)叶酸水平多采用食物频率问卷法进行估计，可能存在测量误差[32]。

四、环境污染物、DNA甲基化与NTDs

多环芳烃(PAHs)是环境中普遍存在的一类有机污染物，人群研究发现：(1)母亲血液PAHs水平增加与胎儿NTDs风险增加有关[33]；(2)胎盘PAHs水平增加与胎儿NTDs风险增加有关[34]；(3)脐带组织和脐带血PAH-DNA加合物水平升高与胎儿NTDs风险增加有关[35]。最近研究报告显示[36]，胎儿紧密联接通路(tight conjunction pathway)基因CTNNA1和MYH2高甲基化与NTD发生有关，而苯并芘暴露与这两个基因高甲基化存在相关性。提示，多环芳烃暴露增加胎儿NTDs风险之间可能是通过改变胎儿神经管发育相关的紧密联接通路基因DNA甲基化水平而起的作用。

砷可通过抑制甲基转移酶3a与3b的表达与活性进而造成后代NTDs的发生，且诱发的NTDs不能通过叶酸拮抗[37]。砷可造成机体氧化应激并导致全基因组低甲基化[38]。胆碱作为一类甲基供体，可拮抗砷导致的NTDs，提高总体DNA甲基化水平[39]。砷对DNA低甲基化的影响，可能与其导致的氧化应激及S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷高半胱氨酸(SAM/SAH)比值降低有关[38]。

五、高糖、DNA甲基化与NTDs

孕期糖尿病作为NTDs的危险因素也可影响DNA的甲基化。将小鼠胚胎神经干细胞置于高糖环境下培养，可观察到部分发育调控基因甲基化与表达的改变[40]。提取孕期高血糖小鼠胚胎组织及其胚胎干细胞，发现孕期高糖导致的氧化应激可使Dnmt3b活性增高，造成Pax3甲基化水平升高，进而导致Pax3表达抑制，诱发NTDs[9]。另一项研究表明，母亲糖尿病可增加子代甲基转移酶3a与3b的表达与活性，进而造成DNA整体甲基化水平及NTDs发生关键基因Grhl3,Pax3与Tulp3甲基化水平的升高；绿茶提取物EGCG可显著降低高糖所致NTDs发病率，其机制可能为EGCG抑制甲基转移酶3a与3b的表达与活性，进而拮抗DNA整体甲基化水平及Grhl3,Pax3与Tulp3甲基化水平的升高[41]。

六、存在的问题及展望

迄今为止，有关DNA甲基化与神经管缺陷的研究结果缺乏重复。因此，甲基化改变与神经管缺陷发生之间的真实关系需要后续更多的研究积累。更为重要的是，DNA甲基化具有组织和时间特异性。胎儿神经管在孕5～6周之间闭合，而人体研究中所获取神经组织标本的时间大多在孕20周(胎龄18周)之后，所测的甲基化状态未必能够反映胎儿神经管闭合时的真实状态。基于胎盘组织、母亲血液、胎儿非神经组织的DNA甲基化研究，更是无法判断与神经管缺陷发生之间的关系。今后的人群研究中，如何获取更接近于胎儿神经管发育时期的标本，是研究的最大难点。另外，不同研究团队之间协作，获得不同人群均存在的特定基因甲基化改变，结果外推的可能性才会增大，才可能具备临床应用价值。

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