孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离和富集

高松 蒋刈 戴朴

产前诊断是遗传性疾病早发现、早诊断、早治疗的重要手段，可以有效减少出生缺陷的发生风险。传统的产前诊断是通过有创的方式，包括羊膜穿刺术、绒毛膜绒毛吸取术、胎儿脐静脉穿刺术，获取胎儿遗传物质用于遗传分析，对胎儿和孕妇有一定的风险[1]。因此，无创产前诊断逐渐成为研究的热点。无创产前诊断中胎儿遗传物质的来源包括孕妇外周血中游离胎儿DNA和完整的胎儿细胞。相对于胎儿游离DNA，胎儿细胞包含胎儿完整的遗传信息，能提供更准确可靠的基因诊断。研究证实，孕妇外周血中主要存在4种胎儿来源的细胞，即滋养层细胞、白细胞、造血干细胞和有核红细胞[2]。4种细胞中胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cells，FNRBC)是最理想的产前检测的来源细胞，其优势包括：(1)胎儿有核红细胞是单核细胞，分化好，形态上易辨别，含有胎儿完整的遗传信息；(2)存活周期约90 d，在母体血循环中不会持续至下次妊娠，因此，作为产前检测细胞来源不受上次妊娠的影响[3]；(3)细胞表面具有特异性的标志物，可作为细胞分选的依据。

胎儿有核红细胞直径约9～13 μm，略大于成熟红细胞的直径(6～8 μm)，与白细胞直径(8～15 μm)相当；密度在1.077 g/ml至1.130 g/ml之间，与成熟红细胞(1.090～1.110 g/ml)相似[4-5]。孕妇外周循环中胎儿细胞数量很少，据估计每1 ml孕妇外周血中约有1～3个胎儿细胞[6]。妊娠的不同阶段，胎儿细胞数量也会有所不同。胎儿有核红细胞自孕6周即可在孕妇外周血中检出，随着妊娠期延长，胎儿有核红细胞数量逐渐增加，每40 ml孕妇外周血中由孕6周时的100个增加到孕末期的1 000个[7-8]。有研究认为，孕妇外周血中胎儿细胞数量与胎儿性别有关，胎儿为男性的孕妇外周血中胎儿细胞数量较多[9]。由于胎儿有核红细胞数量稀少，必须对其进行分离富集，才能用于无创产前检测。

一、孕妇外周血中胎儿有核红细胞分离和富集主要方法

1. 密度梯度离心法(density gradient centrifugation, DGC)：该技术主要原理是根据外周血中各种细胞成份在密度、体积和沉降系数等方面的差异，利用细胞分离液通过离心的方法将目标细胞分离出来。根据所采用的介质密度的不同，可以分为单密度梯度离心、双密度梯度离心和不连续密度梯度离心。二十世纪九十年代，有研究证明该方法在富集有核细胞、去除母源性红细胞过程中的作用。Ganshirt-Ahlert等[10]采用不连续三重密度梯度在非整倍体妊娠的中晚期成功富集了胎儿有核红细胞。Bhat等[11]采用Histopaque 1077、1107和1119三重密度离心的方法，与采用Histopaque 1077单密度离心方法相比，前者对血液模拟样本中有核红细胞的富集效率是后者的25倍。之后，密度梯度离心法成为大部分富集策略的第一步。Sekizawa等[12]评估了不同密度梯度离心法分离胎儿有核红细胞的效率，采用荧光标记的抗γ-血红蛋白抗体分选胎儿有核红细胞，并进一步行FISH分析，结果显示采用1.090 g/ml密度梯度富集的胎儿有核红细胞数量是1.083 g/ml的3倍多。有学者采用Percoll分离液研究胎儿有核红细胞的密度，显示大多数胎儿有核红细胞的密度比白细胞密度大[13]。因此，多数学者倾向采用密度更大的Ficoll 1119做为密度梯度离心法的介质[14-15]。同时有研究[12]比较了Percoll和Ficoll两种分离液的富集效率，针对孕早期模拟样本中回收胎儿原始红细胞，Percoll 1118明显优于Percoll 1117、1119和Ficoll 1119，其平均回收率分别为64.1%、10.1%、5.5%和35.3%。密度梯度离心法操作相对简便，耗时短，费用低，但该技术富集所得胎儿有核红细胞数量少，纯度较低，通常作为富集有核红细胞策略的第一步，后续进一步纯化目标细胞。

2. 荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting, FACS)：FACS是用结合有荧光染料的探针(如抗体)对细胞进行标记，再进行流式细胞分选术。1979年首次报道了采用FACS方法从孕妇外周血中成功分离出胎儿细胞[16]，之后有学者以胎儿有核红细胞上CD71为靶点，应用FACS策略从孕妇外周血中成功获取胎儿有核红细胞，并在怀男胎孕妇外周血细胞中检测到Y染色体序列[17]。 Price等[18]采用密度梯度离心和FACS(细胞大小、粒度、CD71和GPA)相结合的方法从富集的胎儿细胞中分离有核红细胞，进一步用PCR的方法成功鉴定出全部12例男胎以及6例女胎中的5例，染色体特异的核酸探针荧光原位杂交技术(FISH)诊断出1例21-三体和1例18-三体。Bianchi等[19]采用不同的三种抗体(CD71单抗、CD36单抗、GPA单抗)FACS与密度梯度离心相结合的方法分离胎儿有核红细胞后，再行性别鉴定；其中用CD71单抗和CD36单抗的准确率分别为57%、88%；无论单独应用GPA单抗或与CD71单抗、CD36单抗联合应用，结果准确率均为100%。但由于FACS设备昂贵，操作复杂，并且检测通量低，目前并不适用于临床。

3. 磁激活细胞分选法(magnetic-activated cell sorting, MACS)：MACS是一种免疫磁性细胞分离技术，采用结合磁性微粒的单抗与细胞表面的特异抗原结合，然后通过外加磁场，将互相结合的磁性微粒和目标细胞与其它细胞分开。Gänshirt-Ahlert等[10, 20]首次采用Histopaque-1077密度梯度离心结合CD71单抗包被的磁珠成功富集了胎儿有核红细胞；随后，该学者用三重密度梯度离心结合MACS(抗CD71)的方法富集胎儿有核红细胞后，进一步用FISH的方法检测出15例染色体异常的胎儿，其中5例18-三体，10例21-三体。Mavrou[21]等对孕中期母亲外周血中胎儿有核红细胞数量进行了研究，采集受检者20 ml外周血，Histopaque 1 083密度梯度离心，采用MACS(抗CD71)富集，经麦格-姬姆萨(May-Griunwald-Giemsa, MGG)法染色后，显微镜下确认有核红细胞并计数，发现351例样本中306例富集到胎儿有核红细胞，其中染色体正常胎儿孕妇外周血中平均胎儿有核红细胞数为8个(1～12个)，而在染色体非整倍体胎儿孕妇外周血中胎儿有核红细胞数平均为35个(7～113个)。

有学者[22]比较了FACS和MACS对胎儿有核红细胞的富集效率，样本采集自孕妇选择终止妊娠后1 h内的外周静脉血，其中FACS采用γ-珠蛋白抗体，而MACS依次采用CD45和γ-珠蛋白两种抗体筛选策略，纯化的细胞经FISH分析确认细胞来源。结果显示，MACS方法对胎儿有核红细胞有更高的特异性，在后续的FISH分析中细胞丢失较少；而FACS富集胎儿有核红细胞的富集效率更高，纯度也更高；同时，MACS操作时间短，花费低，而FACS需要昂贵的设备和专业人员。2002年，一项多中心临床研究[23]比较了两种检测策略的优劣，MACS对目标细胞的富集效率更高，对胎儿性别的鉴定准确性也更高。

4. 微流控技术(microfluidics)：该技术采用高灵敏度的微流控设备，利用细胞自身形状、大小和变形性等固有特征来分离目标细胞。整个分离过程不需要抗体，并且效率较高。其用于血液组分的提取最初是为了获得血浆或白细胞[24]。2008年，Huang等[25]采用微流控技术在58例孕妇外周血中分离出胎儿有核红细胞，其中在37例普通妊娠中获得经鉴定的有核红细胞平均是37.7个/毫升(0.37～168.2个/毫升)，在21例非整倍体胎儿妊娠中获得的有核红细胞平均是37.2个/毫升(0.99～274.36个/毫升)，有核红细胞产量约为MACS或SBA亲和素分选法的10～20倍；作者虽然能够去除99.99%的白细胞，但白细胞在最终富集样本中仍有8 000～80 000个/毫升。2010年Lee等[26]采用第3代微流控技术对模拟样本中胎儿有核红细胞回收率为74.0%，成熟红细胞去除46.5%。但是在实际应用的效果还未见报道。最近，有学者[27]采用两步法分离有核红细胞，第一步利用红细胞的高度聚集性富集包含有有核红细胞和白细胞的混合产物，第二步利用微流控技术分离出有核红细胞，并采集18例孕妇外周血验证该技术的实际效果；结果显示，每毫升外周血样本处理后可以得到1～396个有核红细胞和0～6个白细胞，有核红细胞纯度为20%～100%。

5. 亲和素分离法：有核红细胞表面含有大量的半乳糖基，而大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)具有半乳糖特异性凝集作用，可选择性黏附有核红细胞，从而达到分离的目的。有学者[28]采集了131例孕6～27周的孕妇外周血，先经密度梯度离心，再采用该技术处理，在96%的孕妇外周血中分离到有核红细胞，平均2.3 ml外周血中可得到(7.8±8.5)个有核红细胞；FISH技术检测8例孕有男胎的孕妇血样，显示超过一半的有核红细胞为胎儿来源。2005年，Babochkina等[29]研究了SBA亲和素分离法和MACS从孕妇外周血中分离有核红细胞的效率，显示前者分离的细胞数比后者高约8倍，并且对细胞形态影响小，易于辨认和分析；但富集细胞中混有大量母体细胞，胎儿有核红细胞纯度明显低于MACS法。最近，有研究[30]对该技术进行了改进，孕妇外周血经密度梯度离心后，采用CD45抗体去除淋巴细胞，之后与半乳糖特异性凝集素连接固定在玻片上，染色后经自动成像分析对细胞进行分类；所有39例样本中均可鉴别出有核红细胞，10 ml血液中可识别出18～6 000个；在14例男胎的血样分离标本中，FISH检测可见10个或以上的有核红细胞来源于胎儿。

6. 单细胞显微操作分离法：二十世纪九十年代中期，有学者[31]采用显微操作的方法分离有核红细胞，并且在大部分样本中准确鉴定出胎儿性别，开创了无创产前诊断的新途径。之后，Sekizawa等[32]采用密度梯度离心结合显微操作的方法获得胎儿有核红细胞，进一步用引物延伸预扩增(primer extension preamplification , PEP)的方法对单个有核红细胞进行全基因组扩增，确定细胞来源于胎儿后，对可能怀有DMD胎儿的孕妇进行了产前诊断。这项技术同样适用于其他X-连锁遗传病的产前诊断。有研究[33]应用类似技术，检测了13例孕妇的胎儿RhD血型，准确率为12/13。但该技术仅局限于对男性胎儿进行诊断。之后，有学者[18]将显微操作技术与多重PCR技术相结合，在单细胞层面研究孕妇外周血中有核红细胞的来源，结果显示胎儿来源的约占一半。单细胞显微操作法不仅能获得单个胎儿细胞，还可对明确为胎源性的细胞进行遗传分析，因此，避免了孕妇外周血细胞的污染问题。

7. 纳米材料与特异性抗体相结合：近年来，随着材料科学的发展，纳米材料与传统技术相融合，在各项研究中的应用日益增多。2016年，武汉大学He等研究人员[34]以羟基磷灰石/壳聚糖纳米颗粒(HA/CTS NPs)在玻璃基质上构建3D纳米结构芯片，可显著增加与修饰抗体(CD147)接触面积，从而提升FNRBCs捕获效率，平均每毫升孕妇外周血捕获25个胎儿有核红细胞；同时由于纳米芯片的良好透光性，可以原位进行FISH检测和染色体非整倍体分析；采用该技术处理10例生育男孩的孕妇外周血，分离出的FNRBCs经三色免疫荧光染色(ε-HbF，CD71，DAPI)鉴定8例为男性，而采用FISH鉴定9例为男性；对胎儿染色体非整倍体的诊断，则准确诊断出7例(4例21-三体，3例13-三体)。2017年初，有学者[35]采用类似纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞，该方法首先经过Percoll 1.077 单密度梯度离心，以玻璃为载体的纳米羟基磷灰石基底上修饰CD147抗体，对孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行捕获，利用HbF、CD71 以及DAPI 对有核红细胞进行标记，实现分选目的；对10 例孕妇外周血样本，均成功分离出胎儿有核红细胞，然后经 FISH 鉴定，该方法对男胎诊断的灵敏度为 85.7%(6/7)，特异度为100%，对女胎诊断的灵敏度为100%，并准确诊断出 1 例21-三体胎儿。

二、胎儿有核红细胞(FNRBC)的鉴定和应用

经过上述各种方法富集纯化的有核红细胞，并不都是胎儿来源。有研究显示，自孕妇外周血富集纯化的有核红细胞中，大约22～50%来源于母亲[21]。因此，在将纯化的有核红细胞用于产前检测前，必须鉴定其为胎源性或母源性。目前常用的方法有：(1)特异性探针FISH分析或对Y染色体特异序列行PCR扩增，但该方法只能鉴定来源为男胎的有核红细胞；(2)免疫标记的胚胎型珠蛋白法，包括ε-，ζ-，和γ-珠蛋白。有研究表明，ε-珠蛋白在孕早期更适合做为胎儿有核红细胞的标志物[36, 37]。

胎儿有核红细胞经鉴定后可以作为产前检测的遗传物质来源，采用相应的分子生物学技术检测疾病。FISH能准确分析胎儿性别和染色体异常，PCR可分析单基因遗传病。Price等[18]首次报道了利用胎儿有核红细胞鉴定胎儿性别和诊断胎儿非整倍体，之后，FISH技术在胎儿非整倍体的检测中广泛展开。有学者自孕妇外周血中分离出胎儿有核红细胞，PCR后检测，诊断镰状细胞贫血和β-地中海贫血各一例[38]。Nagy等[39]分离得到胎儿有核红细胞后利用QF-PCR检测胎儿核型，与羊水穿刺结果比较，符合率为78.6%(11/14)。随着单细胞全基因组扩增技术的逐渐成熟，相信会有更多的遗传性疾病可通过孕妇外周血中的胎儿细胞得到确诊。

三、小结

总之，孕妇外周血中分离富集胎儿有核红细胞的方法众多，这已成为产前检测和遗传学研究领域的热点，并取得了部分进展。但分离富集技术与临床推广应用之间还有一定差距，各项技术或操作繁琐，费时费力；或分离效率不高，细胞纯度不够；不能满足临床实际需求。因此，目前的研究应着重在优化分离富集策略，寻找胎儿有核红细胞特异性分子标志物，并提高自动化分析水平，满足临床大规模应用，从而真正实现无创产前诊断。

1 Schueler PA,Yamanishi DT,Pearson J,et al.Inconsistency of fetal trophoblast cells in first trimester maternal peripheral blood prevents non-invasive fetal testing using this cell target.Placenta,2001,22:702-715.

2 Geifman-Holtzman O,Blatman RN,Bianchi DW.Prenatal genetic diagnosis by isolation and analysis of fetal cells circulating in maternal blood.Semin Perinatol,1994,18:366-375.

3 Pearson HA.Life-span of the fetal red blood cell.J Pediatr,1967,70:166-171.

4 Huang Z,Fong CY,Gauthaman K,et al.Novel approaches to manipulating foetal cells in the maternal circulation for non-invasive prenatal diagnosis of the unborn child.J Cell Biochem,2011,112:1475-1485.

5 Choolani M,O'Donoghue K,Talbert D,et al.Characterization of first trimester fetal erythroblasts for non-invasive prenatal diagnosis.Mol Hum Reprod,2003,9:227-235.

6 Emad A,Drouin R.Evaluation of the impact of density gradient centrifugation on fetal cell loss during enrichment from maternal peripheral blood.Prenat Diagn,2014,34:878-885.

7 Ganshirt D,Smeets FW,Dohr A,et al.Enrichment of fetal nucleated red blood cells from the maternal circulation for prenatal diagnosis:experiences with triple density gradient and MACS based on more than 600 cases.Fetal Diagn Ther,1998,13:276-286.

8 Hamada H,Arinami T,Kubo T,et al.Fetal nucleated cells in maternal peripheral blood:frequency and relationship to gestational age.Hum Genet,1993,91:427-432.

9 Schlutter JM,Kirkegaard I,Petersen OB,et al.Fetal gender and several cytokines are associated with the number of fetal cells in maternal blood--an observational study.PloS one,2014,9:e106934.doi:10.1371/journal.pone.0106934.

10 Ganshirt-Ahlert D,Borjesson-Stoll R,Burschyk M,et al.Detection of fetal trisomies 21 and 18 from maternal blood using triple gradient and magnetic cell sorting.Am J Reprod Immunol,1993,30:194-201.

11 Bhat NM,Bieber MM,Teng NN.One-step enrichment of nucleated red blood cells.A potential application in perinatal diagnosis.J Immunol Methods,1993,158:277-280.

12 Sekizawa A,Farina A,Zhen DK,et al.Improvement of fetal cell recovery from maternal blood:suitable density gradient for FACS separation.Fetal Diagn Ther,1999,14:229-233.

13 Voullaire L,Ioannou P,Nouri S,et al.Fetal nucleated red blood cells from CVS washings:an aid to development of first trimester non-invasive prenatal diagnosis.Prenat Diagn,2001,21:827-834.

14 Samura O,Sekizawa A,Zhen DK,et al.Comparison of fetal cell recovery from maternal blood using a high density gradient for the initial separation step:1.090 versus 1.119 g/ml.Prenat Diagn,2000,20:281-286.

15 Prieto B,Alonso R,Paz A,et al.Optimization of nucleated red blood cell (NRBC) recovery from maternal blood collected using both layers of a double density gradient.Prenat Diagn,2001,21:187-193.

16 Herzenberg LA,Bianchi DW,Schroder J,et al.Fetal cells in the blood of pregnant women:detection and enrichment by fluorescence-activated cell sorting.Proc Natl Acad Sci U S A,1979,76:1453-1455.

17 Bianchi DW,Flint AF,Pizzimenti MF,et al.Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood.Proc Natl Acad Sci U S A,1990,87:3279-3283.

18 Price JO,Elias S,Wachtel SS,et al.Prenatal diagnosis with fetal cells isolated from maternal blood by multiparameter flow cytometry.Am J Obstet Gynecol,1991,165:1731-1737.

19 Bianchi DW,Zickwolf GK,Yih MC,et al.Erythroid-specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood.Prenat Diagn,1993,13:293-300.

20 Ganshirt-Ahlert D,Burschyk M,Garritsen HS,et al.Magnetic cell sorting and the transferrin receptor as potential means of prenatal diagnosis from maternal blood.Am J Obstet Gynecol,1992,166:1350-1355.

21 Mavrou A,Kouvidi E,Antsaklis A,et al.Identification of nucleated red blood cells in maternal circulation:a second step in screening for fetal aneuploidies and pregnancy complications.Prenat Diagn,2007,27:150-153.

22 Wang JY,Zhen DK,Falco VM,et al.Fetal nucleated erythrocyte recovery:fluorescence activated cell sorting-based positive selection using anti-gamma globin versus magnetic activated cell sorting using anti-CD45 depletion and anti-gamma globin positive selection.Cytometry,2000,39:224-230.

23 Bianchi DW,Simpson JL,Jackson LG,et al.Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood:analysis of NIFTY I data.National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study.Prenat Diagn,2002,22:609-615.

24 Ji HM,Samper V,Chen Y,et al.Silicon-based microfilters for whole blood cell separation.Biomed Microdevices,2008,10:251-257.

25 Huang R,Barber TA,Schmidt MA,et al.A microfluidics approach for the isolation of nucleated red blood cells (NRBCs) from the peripheral blood of pregnant women.Prenat Diagn,2008,28:892-899.

26 Lee D,Sukumar P,Mahyuddin A,et al.Separation of model mixtures of epsilon-globin positive fetal nucleated red blood cells and anucleate erythrocytes using a microfluidic device.J Chromatogr A,2010,1217:1862-1866.

27 Byeon Y,Ki CS,Han KH.Isolation of nucleated red blood cells in maternal blood for Non-invasive prenatal diagnosis.Biomed Microdevices,2015,17:118.

28 Kitagawa M,Sugiura K,Omi H,et al.New technique using galactose-specific lectin for isolation of fetal cells from maternal blood.Prenat Diagn,2002,22:17-21.

29 Babochkina T,Mergenthaler S,Lapaire O,et al.Evaluation of a soybean lectin-based method for the enrichment of erythroblasts.J Histochem Cytochem,2005,53:329-330.

30 Kanda E,Yura H,Kitagawa M.Practicability of prenatal testing using lectin-based enrichment of fetal erythroblasts.J Obstet Gynaecol Res ,2016,42:918-926.

31 Takabayashi H,Kuwabara S,Ukita T,et al.Development of non-invasive fetal DNA diagnosis from maternal blood.Prenat Diagn,1995,15:74-77.

32 Sekizawa A,Kimura T,Sasaki M,et al.Prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy using a single fetal nucleated erythrocyte in maternal blood.Neurology,1996,46:1350-1353.

33 Sekizawa A,Watanabe A,Kimura T,et al.Prenatal diagnosis of the fetal RhD blood type using a single fetal nucleated erythrocyte from maternal blood.Obstet Gynecol,1996,87,501-505.

34 He Z,Guo F,Feng C,et al.Fetal nucleated red blood cell analysis for non-invasive prenatal diagnostics using a nanostructure microchip.J Mater Chem B,2016,DOI:10.1039/c6tb02558g.

35 高海侠,刘晓华,岳洁.基于纳米技术从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞并进行无创性产前诊断的可行性.广东医学,2017,38:280-283.

36 Choolani M,O'Donnell H,Campagnoli C,et al.Simultaneous fetal cell identification and diagnosis by epsilon-globin chain immunophenotyping and chromosomal fluorescence in situ hybridization.Blood,2001,98:554-557.

37 Hogh AM,Hviid TV,Christensen B,et al.zeta-,epsilon-,and gamma-Globin mRNA in blood samples and CD71(+) cell fractions from fetuses and from pregnant and nonpregnant women,with special attention to identification of fetal erythroblasts.Clin Chem,2001,47:645-653.

38 Cheung MC,Goldberg JD,Kan YW.Prenatal diagnosis of sickle cell anaemia and thalassaemia by analysis of fetal cells in maternal blood.Nat Genet,1996,14:264-268.

39 Nagy GR,Ban Z,Sipos F,et al.Isolation of epsilon-haemoglobin-chain positive fetal cells with micromanipulation for prenatal diagnosis.Prenat Diagn,2005,25:398-402.