斯库台涡虫属一新种(单肠目，斯库台科)及其分子系统学分析

陈龙， 冯伟涛， 林逸涛， 卢素雅， 汪安泰

(深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳518060)

首例切头类涡虫于1846年在圣地亚哥Santiago被发现，当时将其归属于环节动物门水蛭类(Moquin-Tandon，1846)。之后，因其体表光滑、具吸盘，组织学结构具有扁形动物特征，建立了切头纲Temnocephalida，分类地位介于 “涡虫纲Turbellaria”与吸虫纲Trematoda之间；经过对其形态、分类、分布等的研究，又将其归为“涡虫纲切头目Temnocephalida”(唐仲璋，1959)。随着分子系统学技术的发展与研究的深入，原“涡虫纲”内容发生很大变化：无肠目Acoela被移出扁形动物门Platyhelminthes，其余物种被划分为链虫纲Catenulida与被杆体纲Rhabditophora，切头目降为切头亚目Temnocephalida，归属于单肠目Rhabdocoela(汪安泰等，2005a)。

斯库台涡虫属Scutariella隶属于扁形动物门被杆体纲单肠目斯库台科Scutariellidae。该科物种体表光滑，无纤毛，头部有触角，尾端有吸盘，部分种类具有柄，静止时，随水流摆动，以吸盘吸附在甲壳类额剑、足、口器等部位(Ohtakaetal.，2012)，移动时呈尺蠼式运动；具有吸食宿主血淋巴的习性，被认为是研究自由生活、外共生、寄生生活方式转变的重要素材(Williams，1986)。一般认为其触角、吸盘及柄为重要分类依据(Joffeetal.，1998)。

该属迄今记录4种，即ScutarielladidactylaMrazek，1907、S.georgicaJoffe & Djanashvili，1981、S.stammeriMatjasic，1958及S.japonica(Matjasic，1990)，其中，S.japonica最早的学名是CaridinicolasinicaMatjasic，1990，后由Kawakatsu等(1999)重新定名为日本斯库台涡虫S.japonica。亚洲仅记录日本斯库台涡虫(Kawakatsuetal.，1999)。据Ohtaka等(2012)报道，日本斯库台涡虫在日本和中国东南区域有分布。

本研究在广东省河源市溪流内采集到斯库台涡虫属标本，对其展开形态学、组织学、分类学以及18S rDNA和28S rDNA系统进化分析，并与日本斯库台涡虫做了仔细对比与讨论，最后鉴定为中国斯库台涡虫，新种Scutariellasinensissp. nov.。

1 材料方法

1.1 采集与培养

标本采自广东省河源市东源县(115°3′E，23°58′N)水沟。用200目浮游生物网在水沟中来回扫网，网内物置于桶中摆洗，静置10 min，用60目网滤除粗渣，最后用200目网浓缩后装入保鲜盒，带回实验室分离。分离的涡虫在器皿中饥饿处理备用。

1.2 标本制备

方法同林逸涛等(2017)，使用生境水配制的5%～7%乙醇麻醉液处理标本，改良Bouin氏液(甲醛∶乙酸∶饱和苦味酸∶水=15∶8∶70∶7)固定1 h，水洗2 d。石蜡切片与模式标本制作使用HE染色法，常规方法制片。石蜡切片使用莱卡切片机(Leica RM2235)，切片厚6 μm。

1.3 分子系统学分析

试剂及方法见林逸涛等(2017)。18S rDNA引物为TimA、TimB和Poly18SR2，28S rDNA引物为LSU5、LSUD6-3、Poly28SF1和Poly28SR2(表1)。所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。分子系统学分析所用序列均来源于GenBank(表2)。本文将中国斯库台涡虫3个个体与切头总科Temnocephaloidea中4属各1种，单肠目中3亚目涡虫各3种，吸虫纲Trematoda中3种，水螅纲Hydrozoa中1种的18S rDNA和28S rDNA基因拼接序列，MEGA 6.0进行序列对比，删减序列至最短。

表1 引物及PCR条件Table 1 Primers and PCR protocols

使用MEGA 6.0与MrBayes分别完成最大似然树与贝叶斯树构建，其中，贝叶斯树用FigTree v1.4.3修饰并导出。

1.4 观察与测量

同林逸涛等(2017)。

1.5 缩写词

b.脑brain，e. 眼eyes，eg. 嗜曙红腺eosinophilic glands，g. 生殖腔gonocoel，go. 生殖孔genital opening；i. 肠intestines，m. 口mouth，o. 卵巢ovary，od. 输卵管oviduct，p. 咽pharynx，pg. 咽腺pharyngeal glands，ps. 交配刺penis stylet，rs. 受精囊receptaculum seminalis，s. 吸盘sucker，t. 精巢testis，te. 触角tentacle，vd. 输精管vas deferens，vg. 卵黄腺vitelline glands，vgd. 卵黄腺管vitelline glands duct，vs. 储精囊vesicula seminalis。

表2 物种基因序列的GenBank登录号Table 2 GenBank accession numbers of the sequences

2 结果

2.1 中国斯库台涡虫，新种Scutariella sinensis sp. nov. Wang & Chen(图1，图2)

模式标本：正模PLA-Sc001(扁形动物门-斯库台涡虫属)，整装片，于2017年1月采自广东省河源市(115°3′E，23°59′N)水沟，水温18 ℃，采集人张吕。副模PLA-Sc002，整装片；PLA-Sc003，连续切片，采集记录同正模。所有标本均保存于中国科学院国家动物博物馆。

整体形态：虫体扁平，光滑，乳白色，长2 460～2 610 μm，宽300～330 μm(n=3，图1：A～B；图2：A)。2个触角位于虫体前端，呈指状，分7节，可伸缩，长70～96 μm，基部长约180 μm，基部宽约100 μm(图1：A～D；图2：A)，口位于两触角间，花萼状。咽位于口道后方，呈子弹头形，长600～640 μm，基部宽100～120 μm(n=3)，其上分布有丰富的神经细胞。咽后连接肠道，咽与肠交界处的外侧分布有咽腺(图1：C～D；图2：A)。两眼点对称分布于虫体前1/3 处，呈半月状，凹面向内，长26～29 μm，宽16～17 μm(n=3)。脑位于眼点腹侧，具脑室(图1：C～D，H)。肠为长筒状，长960～1 000 μm，宽70～80 μm(n=3)。虫体尾部具“C”形吸盘，不具柄。

生殖系统(图1：C～G；图2：A～D)：雄性生殖系统由精巢、输精管、储精囊、交配刺构成。精巢呈椭圆形，位于肠的前1/3两侧，长200～215 μm，宽100～129 μm(n=3)。精巢的前部为精子，后部为精原细胞。输精管基部膨大与精巢前部融合，具贮存精子的作用。2条输精管向体中轴延伸汇合为输精总管，再向后延伸连接至储精囊。储精囊位于肠的前1/3处的腹侧，近球形，长51～61 μm，宽38～42 μm(n=3)。交配刺起始于储精囊，呈细管状，长446～451 μm(n=3)，外被套膜，末端开口于生殖腔。生殖腔位于咽后肠前端腹侧，长80～85 μm，宽54～57 μm(n=3)。生殖腔周围组织内分布有卵壳腺。雌性生殖系统由卵巢、受精囊、输卵管和卵黄腺构成。卵巢位于肠的前1/3位置的腹侧，2个精巢之间，球形，长130～132 μm，宽135～138 μm(n=3)，其右后方有1根输卵管通往生殖腔后端。输卵管两端管径较大，长117～140 μm (n=3)。受精卵经输卵管移至生殖腔完成剩余发育过程。受精囊位于卵巢和输卵管交界处，球形，长41～42 μm，宽30～35 μm(n=3)，储存有异体精子。2条卵黄腺始于咽后两侧，沿肠道两侧向后延伸，在肠道后部背侧汇合，整体呈显著的“U”型。卵黄管分别从左侧卵黄腺前1/3处与右侧卵黄腺1/2处发出，共同汇合于输卵管近受精囊一端。所有标本中均发现大型卵黄腺细胞。

图1 中国斯库台涡虫，新种
Fig. 1Scutariellasinensissp. nov.

A. 收缩时自然形态； B. 舒展时自然形态(暗视野)； C. 整体压片(HE染色)； D～I. 矢状切片(D～F. 近腹侧，示生殖腔、咽腺、嗜曙红腺)； G. 大型卵黄腺细胞； H. 咽； I. 肠后愈合的卵黄腺； 比例尺： A～C=200 μm， D～I=50 μm

A. living specimen when contract； B. living specimen when relax (dark field view)； C. whole-mounted specimen (HE staining)； D-I. sagittal sections (D-F. ventral view， showing gonocoel， pharyngeal gland， eosinophilic glands)； G. large cells of vitelline glands； H. pharynx； I. fused vitelline glands at the posterior end of the intestine； scale bars： A-C=200 μm， D-I=50 μm

图2 中国斯库台涡虫，新种模式图Fig.2 Scutariella sinensis sp. nov. patterns

A. 整体形态(腹面观)； B. 眼点局部图； C.生殖系统； D. 卵巢、输卵管、受精囊、卵黄腺管交汇位置； 比例尺： A～B=200 μm，C=100 μm，D=50 μm

A. whole specimen (ventral view)； B. partial organizations around eyes； C. the reproductive systems； D. the fusing position for ovaries， oviduct， receptaculum seminalis， vitelline ducts； scale bars： A-B=200 μm， C=100 μm， D=50 μm

2.2 分子系统学结果

18S rDNA 和28S rDNA均具有高度保守性，因此常将二者作为确定物种进化地位的重要依据，并以此判断物种间亲缘关系。本研究中最大似然树和贝叶斯树的拓扑结构基本一致(图3)。珠江水螅Hadrazhujiangensis作为外群位于系统树最基部，中国斯库台涡虫，新种3个个体聚为一支，并与切头亚目其他3种涡虫Diceratocephalaboschmai、Temno-sewelliaminor、Temnocephalafasciata及Didymorchissp.以100%的支持率聚为一支。此支系以90%以上支持率与达氏亚目Dalyellioida支系和盲扁亚目Typhioplanoida支系分离。三支系彼此独立，在分子进化上存在较大差异，在分类地位上处于相同等级，共同隶属于单肠目。且切头亚目支系与吸虫纲不存在亲缘关系。

图3 18S rDNA和28S rDNA拼接系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of 18S rDNA and 28S rDNA

A. 最大似然树(bootstrap=1 000， Tamura-Nei type)； B. 贝叶斯树

A. Maximum Likelihood tree (bootstrap=1 000， Tamura-Nei type)； B. Bayesian tree

3 讨论

斯库台涡虫属迄今已知4个物种：S.didactylaMrazek， 1907分布于黑山共和国，S.georgicaJoffeetal.， 1981分布于西格鲁吉亚，S.stammeriMatjasic， 1958分布于波黑，日本斯库台涡虫分布于日本千叶市(Kawakatsuetal.，1999)。上述物种在动物地理方面均属于古北界。日本学者在中国的广东、福建、江西、安徽及浙江采集到斯库台涡虫属物种，认为其是日本斯库台涡虫(Ohtakaetal.，2012)。

S.stammeri体长1.3～1.5 mm，常出现眼点丢失(Matjasic，1958)。S.didactyla眼点位于咽和肠交界处，卵黄腺在中间分段，完全包裹肠道(Mrazek，1907)。S.georgica具2对左右对称的卵黄腺，肠中部内陷(Joffe & Dzhanashvili，1981)。中国斯库台涡虫，新种体长约2.5 mm，眼点位于咽外侧，肠道无内陷，2支卵黄腺沿肠道两侧分布，并在肠后端背侧汇合，整体呈“U”型，与上述3个物种区别十分显著。

日本斯库台涡虫的形态学数据不够完善，之后有学者做了一些补充(Kawakatsuetal.，1999)，但仍缺乏细致的相关数据：无咽腺与卵黄管分布描述，未指明精巢内精子及精原细胞的分布特征。该物种主要特征：受精囊与卵巢相距较远。子宫与生殖孔位于咽后腹侧，肠长度的前1/4位置，与输卵管直接相连，交配刺与子宫共同开口于生殖孔。卵黄腺分为4条，分布于肠的2侧。

中国斯库台涡虫，新种Scutariellasinensissp. nov.(Ss)与日本斯库台涡虫Scutariellajaponica(Sj)在形态学上较为相似，二者的鉴别特征乃存在明显差异：(1)Ss的2支卵黄腺在背部两侧沿肠管分布，在近肠后部愈合，整个卵黄腺呈“U”型，Sj的卵黄腺在肠后部不愈合；(2)Ss的生殖孔位于肠前端腹侧，Sj的生殖孔位于肠腹侧的前1/4处；(3)Ss的咽腺丰富，位于咽肠交界处的两侧，Sj无咽腺；(4)Ss的精巢、卵巢位于肠道前1/3腹侧，Sj的精巢、卵巢位于肠道中部腹侧。故新种是成立的。

本研究首次提供了斯库台科物种的分子系统学数据。至于在中国的广东、福建、江西、安徽及浙江采集到的日本斯库台涡虫(Ohtakaetal.，2012)，本文认为，有可能是中国斯库台涡虫。目前尚未见日本斯库台涡虫的分子系统学数据，这个问题有待后续研究。

国际动物学界对涡虫研究已有200年历史，资源探索接近尾声。中国学者对涡虫的研究起步较晚，进展缓慢，现仍处于起步阶段(孙婷等，2016)。21世纪前，中国共发现涡虫21种，21世纪以来，共发现涡虫51种(Sunetal.，2015；Fangetal.，2016；Heetal.，2016；Dongetal.，2017；Linetal.，2017a，2017b；Wangetal.，2017)，其中，单肠目涡虫共3科5属26种(张吕等，2017；林逸涛等，2017；Linetal.，2017a)。其中，达氏科Dalyelliidae共19种(Tu，1934；汪安泰，2004；汪安泰，李慧，2005；汪安泰，吴海龙，2005a，2005b；汪安泰，邓利，2006；汪安泰，吴海龙，2008；张小英等，2010；汪安泰，孙源，2011；赖晓婷等，2013；Luetal.，2013；Xiaetal.，2014；Zhangetal.，2014；容粗徨等，2016；Linetal.，2017a；张吕等，2017)，多数分布于广东省沿海地区，海栖类单肠目涡虫的生物多样性研究才开始(Linetal.，2017a)。中国在动物地理方面横跨古北界和东洋界，自然地理、气候与生境十分多样，海岸线超过30 000 km，预示有更多的物种待发现。

致谢：2013级张吕同学多次协助采集本文样本，谨此感谢！

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