青海省海北州牛病毒性腹泻病血清学调查

朱玲

牛病毒性腹泻病，又称牛黏膜病，是由牛病毒性腹泻一黏膜病毒引起牛、羊、猪、鹿以及驼科动物等多种动物感染的一种重要传染病，严重危害我国养牛业的发展。该病主要表现为被感染动物腹泻、脱水、电解质失衡、持续感染与免疫耐受及母畜流产、产死胎和畸形胎等特征。牛病毒性腹泻一黏膜病呈世界分布，尤其是欧美等畜牧业发达国家地区，血清抗体阳性率很高。每年世界各地死于该病感染的牛不少于500万头，由于持续感染等造成的间接损失达到数百亿美元。目前，在我国养牛业集中的省份冬春季发病率较高，已有20多个省份报道有该病，我国将其规定为三类动物疫病。

目前，有多种血清学方法用于牛病毒性腹泻病的诊断，国内外多用完整的病毒粒子为抗原检测BVDV抗体水平。为初步掌握青海省海北州牛病毒性腹泻一黏膜病毒病的感染水平和流行规律，本实验我们应用间接酶联免疫吸附试验（ELISA），对该地区5个规模化养殖场及部分散养牛只感染状况进行了血清学筛查，以期对该病在本地区的流行情况提供参考，为该病的净化和综合防控提供依据，对畜产品健康发展和人类健康都具有重要意义。

1材料与方法

1.1血清样品

采集青海省海北州5个规模化牛场6月龄以上牛血清共计140份，散养户血清16份。全部采用颈静脉抽取适量的血液，做好标记。将采集的血液摆成斜面，于37℃恒温培养箱静置1～2h，置于4℃冰箱中24h后分离血清，保存待检。

1.2主要试剂

牛病毒性腹泻病毒抗体检测试剂盒购自北京爱德士元亨爱生物科技有限公司（IDEXX），阴性、阳性血清和标准阳性血清及稀释液等均来自试剂盒内，在有效期内使用。96孔平底酶标板，移液器配套移液枪尖若干。

1.3间接酶联免疫吸附试验检测方法

间接ELISA具体检测方法按照试剂盒说明进行操作，具体步骤如下：

1）試剂的准备。20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

2）洗板方法。甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板4次。

3）从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，设置阴性、阳性对照孔和样本孔，每个样品重复检测2个孔，每孔加入各50uL。

4）将各孔待测样血清病毒混合物按次序转移至ELISA板上，每孔先加待测样本10uL，再加样本稀释液40uL。

5）随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原100uL，用封板膜封板，37℃温育1h。同上洗板5次，吸水纸上拍干。

6）每孔加入底物A、B各50uL，37℃避光温育15min。

7）每孔加入终止液50uL终止反应，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值，进行结果判定。

1.4结果判定

血清中牛病毒性抗体按照试剂盒说明书进行结果判定。计算待检血清的S/P值，阴性对照孔OD平均值必须小于或等于0.15，阳性对照孔OD平均值必须大于或等于1.00时检测结果才有效。先确定出临界值为阴性对照孔平均值+0.15，以样品校正OD/阳性对照OD大于0.3为阳性。

2结果与分析

由间接酶联免疫吸附试验测得结果显示：待检的156份血清，阳性数为57份，阳性率为11.1%～52.0%，5个规模化养殖场及散养牛血清均能检测到阳性病例，但不同牛场该病的感染率差别很大，平均感染率为29.5%，最高的牛场阳性率可达52.0%。散养牛感染率较低。该结果表明青海省海北州地区牛群存在普遍的牛病毒性腹泻病感染，应及时采取措施予以控制和净化。

3讨论

牛病毒性腹泻病是养牛场常见的多发传染病，引起多种动物感染，分布广泛，以发热、腹泻、脱水及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征，常呈持续性感染，严重危害患病牛群的免疫功能，给养牛业的发展造成了巨大的经济损失。近年来牛病毒性腹泻在我国发病报道日趋增多，流行情况严峻，很多部门加强了对牛病毒性腹泻特点和流行病学调查的研究，加快了对牛病毒性腹泻的监测控制和净化根除工作。而ELISA方法是具有特异性强，灵敏度高，重复性好的一种血清学方法，可以检测出牛病毒性腹泻病的抗体阳性率，反映该病的流行情况，确定感染率。便于及时对患病牛进行隔离或淘汰，清除传染源。

本实验为了阐明牛病毒性腹泻病毒（BVDV）在青海省海北州地区牛群的感染状况，笔者对其中五个规模化牛场以及散养牛群的血液样品156份牛血清进行BVDV血清抗体的检测分析，结果发现青海各地牛群存在普遍的BVDV感染，不同牛场该病检测结果差别很大，感染率为11.1%～52.0%，主要见于规模化牛场，而散养牛感染以散发为主，感染率较低。出现该结果也可能与笔者抽检样品中散养牛数量有限，多数样品来自规模化牛场有关，因此试验结果具有一定的局限性。

随着我国奶牛和肉牛养殖业的发展，牛传染病的流行状况与以往相比较发生了巨大变化，出现了很多新发型疾病及传人型疾病，给养牛业带来巨大经济损失。因此养牛场应加强平时的饲养管理，坚持自繁自养的方针。养殖场应做好圈舍定期卫生消毒工作，保证圈舍的清洁、干燥，对病牛污染的场所应严格消毒，进行无害化处理。根据牛病毒性腹泻病的流行特点，坚持以预防为主，对牛病毒性腹泻常发区定期用猪瘟弱毒苗对牛群进行预防免疫。endprint