一株羊源粪肠球菌的分离鉴定

邱青瑞

摘要：为了对一例疑为粪肠球菌感染的羔羊进行病原鉴定，本研究采用常规细菌分离鉴定方法和PCR方法分别进行分离与鉴定。结果根据菌落形态、细菌染色特性及生化特性，鉴定出分离的细菌为羊源粪肠球菌。

关键词：粪肠球菌；培养特性；生化特性；溶血

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）属于链球菌科肠球菌属，是链状排列的革兰氏阳性球菌，在自然界和动物粪便中大量存在，是人和动物肠道内的主要菌群。粪肠球菌感染对畜牧养殖业的影响不容忽视，该菌为机会感染菌，且对多种抗生素都有耐药性，发病一般呈散发性流行，当畜群受应激等外源因素导致免疫力降低时可发生感染，目前国内已有粪肠球菌引起牛、羊、猪、水貂、鹧鸪和家禽发病的报道。因此，通过实验室对病原菌分离培养及分子生物学鉴定对粪肠球菌的防控具有重要意义。

2016年11月山东东营某羊场羔羊发生了一种以败血症和神经症状为主要特征的传染病，该病发病急，羔羊发病后预后不良，死亡率高达20%以上，给羊场造成了巨大的经济损失。发病羔羊出现体温升高，高达41～42℃，精神沉郁，消瘦衰弱，以及呼吸困难等症状，个别病羊全身抽搐、站立不稳。剖检整个脑部表面及切面均有出血点，严重者有灰色坏死灶，肺脏呈弥漫性充血、出血，外观呈大理石样；脾脏及肠系膜淋巴结肿大。采集发病羔羊的病料经实验室进行细菌分离培养、生化鉴定、动物回归试验及PCR检测确定为粪肠球菌感染。

1材料与方法

1.1主要试验材料

病料分别采集于山东东营几个羊场死亡的羔羊，体重为18～20g的健康小鼠购自新疆大学实验动物中心。

1.2主要试剂

TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNAMarkerDL2000等购自大连宝生物工程有限公司。胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。链球菌琼脂（K-F）、细菌生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司。MH培养基、酵母浸出物、胰蛋白胨等试剂购北京索莱宝科技有限公司，其他化学试剂如氯仿、异丙醇和乙醇等均为国产分析纯产品。

1.3细菌的分离培养

剖检死亡羔羊，无菌采集部分病死羔羊脑、脾脏、肺脏和肠系膜淋巴结，用作细菌分离。将肺脏、脑及肠系膜淋巴结等病变部位研磨后接种于血液琼脂培板、链球菌增菌培养肉汤及改良马丁肉汤中，分别于放置于37℃的C02培养箱中培养24h，观察生长情况及菌落特征。细菌涂片，分别进行革兰氏、吉姆萨或瑞氏染色，镜检。

1.4细菌的生化鉴定

将所分离细菌的鲜血马丁肉汤培养物，进行高盐等不同培养条件鉴定，并挑单菌落转移接种于生化反应管，根据杭州天和微生物试剂有限公司说明书进行，观察生化特性鉴定结果。

1.5溶血实验

将所分离的粪肠球菌接种于5%的兔鲜血LB平板，37℃培养48h后鉴定溶血性，以菌落周围出现溶血圈者判为阳性。

1.6细菌的致病性动物回归试验

将分离的粪肠球菌用灭菌鲜血马丁肉汤增菌培养12～24h，选取体重为18～20g的健康小鼠8只，随机分成2组，每组4只，第1组小鼠腹腔注射0.2mL/只，第2组腹腔注射鲜血马丁肉汤作为对照组。

1.7细菌的PCR鉴定

从GenBank中下载粪肠球菌序列，参照马立艳等文献中16srRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物大小为1，056bp，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2结果与分析

2.1细菌的分离培养

取病变部位直接涂片瑞氏染色镜检可见短链排列的球菌，研磨后接种培养基后革兰染色可见长链状排列的革兰阳性球菌，接种兔鲜血LB平板后出现表面光滑湿润、边缘整齐的圆形小菌落，呈？溶血，能在6.5%Nacl和PH9.6的条件下生长。

2.2细菌的生化鉴定

本实验分离的粪肠球菌糖发酵特性不活泼，只能发酵葡萄糖、甘露糖，乳糖、硫化氢、氧化酶试验、柠檬酸盐和甲基红试验均为阴性，VP试验呈阳性。

2.3细菌的致病性动物回归试验

将分離的粪肠球菌用鲜血马丁肉汤增菌培养24h，腹腔接种健康小鼠后，第1组小鼠出现神经症状，均在48～72h内死亡，对照组小鼠无明显临床症状。剖检死亡小鼠，脑部有灰色坏死灶，肺脏呈大理石样，肠系膜淋巴结肿大。取其脑及肺脏涂片染色镜检为革兰氏阳性球菌，瑞氏染色结果也相同。

2.4细菌的PCR鉴定

提取分离菌株的DNA为模板，以不加模板为阴性对照，通过特异性的16srRNA通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见1056bp左右的特异条带，与预期目的条带位置一致，阴性对照未见条带（图1）。

3讨论

粪肠球菌是人和动物肠道内的主要菌群之一，该菌不仅是人肠球菌感染和死亡的主要致病菌，而且近年来畜禽感染粪肠球菌的报道也越来越多，该菌作为新的人畜共患传染病病原菌，引起了人们广泛关注。本试验中分离的病原菌从培养特性、染色镜检、溶血特性及生化特性分析都符合粪肠球菌的生物学特性。因此可初步判定该分离菌为致病性粪肠球菌。将分离菌的培养产物接种小鼠后，出现败血性及神经症状，动物回归试验证实该菌具有较强的致病性，剖检症状与粪肠球菌的症状一致。

目前对分离菌常根据典型临床症状、剖检病理变化及细菌分离培养特性、染色及生化特性等进行分离鉴定。但链球菌种类繁多，该肠球菌与普通链球菌的不同在于在生化反应上能耐受高盐和高SSS碱培养，溶血特性也相同。分子生物学鉴定肠球菌的保守16SrRNA基因鉴定方法日益受到青睐，该方法快速简便，准确率高。本实验采用传统细菌分离培养鉴定方法和分子生物学方法，对采集自病死羔羊的分离细菌进行了全面鉴定，结果显示为粪肠球菌感染。endprint