96孔U型反应板在县级兽医实验室抗体检测中的应用

左文兵+林贯树+高伯建

摘要：县级獸医实验室主要承担着动物疫病（口蹄疫、高致病性禽流感、猪瘟、猪高致病性蓝耳病、新城疫、布鲁氏杆菌病和牛结核病）免疫抗体效果监测、疫病诊断、流行病学调查、重大动物疫情的风险评估和预警预报等主要任务。在动物疫病预防控制，特别是重大动物疫情预防控制工作中发挥着重要作用。现在市场上进口的全自动酶免工作站由于价格昂贵，大多数的县级兽医实验室都没有配备，所有的抗体检测实验需要手工操作。在实验室抗体检测操作工作中，笔者利用96孔U型反应板的排列布局，集中添加检测血清样品，大大减少每次检测实验重复添加血清样品的时间和检测结果记录及统计时间。

关键词：96孔U型板反应板；ELISA检测试验；血凝抑制试验；样品排顺

在兽医实验室检测操作中，各种ELISA抗原包被板和血凝抑制试验96孔U型板排列都是和96孔反应板结构及位置一致的，实验室检测常用的检测方法主要是ELISA检测方法和血凝抑制试验检测方法。笔者以前实验时，每种动物的被检血清样品要根据检测项目每检测一次要加样血清一次，而且每次实验一般要检测几个检测项目。在每年的春、秋2季动物疫病抗体检测工作量大的时候，有的实验或要做几天才能完成，被检的血清样品按照实验要求需要冷藏或者冷冻保存，如果反复冻融对检测结果会有很大影响，在实验室实际操作中，用时最多的时间主要用在添加被检血清样品上。笔者根据江苏省动物疫病预防控制中心老师的培训指导和全自动酶免工作站的工作原理，在实际操作中改进了原来实验时的血清样品的加样方式，根据检测项目和检测量的需要，将血清样品根据实验试剂盒的要求，收样时在样品架上按照96孔反应板的位置做好的相应对应顺序排列，在实验前做好准备，一次性集中抽取足量的被检血清，放入96孔反应板空中，封膜备用，根据实验时间要求，估计实验室环境温度，按照室温保存或者放在冰箱中4～C冷藏保存备用。96孔反应板每孔可以存放动物血清样品200μL左右。在做实验项目检测时，根据不同试剂盒实验需求的血清样品用量，用相应规格的8或12道等多道移液器添加血清样品，这样就可以不用每次检测加样时再重复分别一一抽取被检血清样品，做到一次足量抽取血清样品，多次加样检测的使用目的。减少实验项目检测的加样时间，同时减少环境温度对检测结果的影响。现在将笔者在动物疫病抗体检测工作中的96孔ELISA反应板的运用介绍如下，不妥之处，请同行批评指正。

1接样排版

1.1家禽的血清样品排版

家禽的抗体检测方法主要是用血凝抑制试验，接收到合格的样品后，在96孔样品离心管架上将被检样品按照竖例A1到H1顺序排列，依次排版96孔板，血凝抑制试验每版可以排96个被检样品。排好后在样品离心管架上做好相应版号标记，在记录纸上按照排版位置，记录一一对应的排列顺序位置，记录也可以运用计算机表格软件进行，自制记录排版顺序位置表。打印或者复印此表，作为实验检测结果统计的母表，记录和统计时用双色笔对检测结果进行记录和统计（如表1）。

1.2猪、牛和羊血清样品排版

猪、牛和羊的抗体检测方法主要是用ELISA方法，ELISA试验每板可以排92个被检样品。每次检测项目时，被检样品数量不一定都能排满92孔板，根据实验实际检测量，按照试剂盒要求可以做88～92个样品板。为了方便检测添加被检样品和方便结果统计，增加实验的准确性，减少实验中因为阴、阳对照的误差对实验的影响，增加实验的成功率，笔者在实际实验操作中，对样品排不满92孔板时，我们一般一板做88样品，把包被反应板的第一列竖向排A1到H12空留8格，留作做两个阴、阳对照孔，在96孔反应板上，将被检测血清样品从第2列至12列以横向A2～A12、B2～B12的顺序依次排板，以此类推。这种排版方法适用做猪瘟ELISA抗体检测、猪高致病性蓝耳病ELISA抗体检测和口蹄疫结构蛋白VP1ELISA抗体检测等几种动物疫病的抗体检测（如表2）。

1.3口蹄疫液相

口蹄疫液相阻断ELISA的实验安排在其他实验做完后再做，根据口蹄疫液相阻断ELISA的试剂盒的实验要求，阴、阳对照放在最后2列排列，这样就和其他ELISA抗体检测的位置排列不一致，口蹄疫液相阻断ELISA的每个包被板只能做10份检测样品或者20份检测样品，操作时把96孔样品板中的被检样品以横向排列方式（如表3）。

2加被检血清样品

根据动物抗体检测项目中实际的检测需要量，每个被检测样品按照样品记录表的排序一一对应，使用相应规格的8道或者12道移液器将被检测血清样品按照实验检测项目不同的试剂盒要求的样品量，分别加入相对应排序位置的抗原包被反应板孔中，在实验检测加样过程中，样品中水分会因为蒸发而发生样品量减少，抽取样品时，抽取样品的量应多于检测需要量。以县级动物疫病控制中心实验室的检测项目任务，加入96孔反应板中家禽的血清样品量（家禽主要检测高致病性禽流感Re-6株、Re-7株、Re-8株、H7N9和鸡新城疫等抗体检测项目），以不低于180～200μL足量加入96孔v型反应板中，猪牛羊的血清样品（主要做口蹄疫液相阻断ELISA、口蹄疫结构蛋白VPlELISA、猪瘟抗体ELISA、猪高致病性蓝耳病ELISA等）以200μL足量加入96孔U型反应板中保存备用，确保所有实验做完后，96孔反应板中的血清样品孔内还有一定量的血清样品，否则被检测样品量不足时，还需要再重新添加样品，增加实验加样用时。

血清样品加完一版立即封膜一版，保存一版，同时根据检测项目需要，置常温保存或者放入冰箱4℃冷藏保存备用。在实验检测过程中，每做一次检测项目要换一次新的封膜封板一次，以防止血清样品在实验过程中受到污染并防止血清样品中的水分蒸发，在最短时间内用完，切记被检测的血清样品不可反复冻融。否则导致实验检测结果不准确，从而造成实验失败。

3实验结果记录和统计

实验结束后，在结果记录纸上或者打印好的96孔排序表上或者运用电脑软件上的电子表格上直接记录检测结果，同时找出可疑和不合格的动物血清样品，必要时对可疑样品做复检。这种运用96孔反应板的统计方法，因为几种实验的96孔反应板和试剂盒抗原包被板位置一致，排版表可以做到一表多用，记录统计检测结果直观，准确，便捷，节约记录统计时间，大大提高实验室检测工作效率。

4结语

随着现代畜牧业快速的发展，养殖企业越来越重视兽医实验室监测在动物疫病监测及免疫程序制定中的指导作用。虽然县级兽医实验室功能室设置都比较齐全，但是各地动物疫情监测经费投入还有不足，而且因全年检测量、检测任务和监测经费等原因的制约，现有的县级兽医实验室实验操作都是以纯手工操作为主，自动化ELISA检测工作站先进的设备配备极少。为了按时完成省、市下达的各项抗体检测任务。县级兽医实验室的主要工作是根据上级有关要求，做好春防、秋防集中疫病检测和日常检测工作，重点检测国家实行强制免疫的猪瘟、口蹄疫、高致病性蓝耳病、禽流感和鸡新城疫等几大疫病的免疫抗体水平。用96孔U型反应板在动物疫病抗体检测中按照固定格式顺序排版集中一次加样，多次使用，可以大大减少实验时间，特别在春防、秋防集中疫病检测工作中运用效果尤为突出。endprint