江西古桑树桑叶中活性成分含量的测定

黄金枝 俞燕芳 杜贤明 邓真华

(江西省蚕桑茶叶研究所 330202)

我国自古就有栽桑养蚕的传统，全国各地遗留下来的古桑树是我国栽桑养蚕的活化石。由于自然和人为原因，这些古桑树的生存现状不容乐观，目前幸存的千年古桑树已为数不多。这些经历千年风霜的古桑树，不仅彰显了我国是栽桑养蚕的发源地，且给世人留下了观赏古桑树风貌的机遇，同时这些上千年、数百年的古桑树也给我们留下了很多动人的传说[1]。近年来江西省蚕桑茶叶研究所经多方咨询考察，发现江西省古桑树资源分布较多地方为吉安地区。

桑叶的主要成分除水分以外，还含有丰富的蛋白质、碳水化合物、 无机盐、维生素以及人体所需的多种微量元素，具有降血压、降血脂、抗衰老、增加耐力、降低胆固醇、抑制肠内有害细菌繁殖和过氧化物产生等独特的功效，对人体有良好的保健作用[2]。桑叶中含有黄酮及其苷、生物碱、多糖、挥发油、各种氨基酸、微量元素等[3]，成分比较复杂，黄酮类成分是主要有效成分之一[4]。桑叶黄酮具有抗衰老作用[5]和抑菌活性[6]，生物碱类中主要的功效成分1-脱氧野尻霉素是α-葡萄糖甘酶抑制剂，具有降血糖、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤转移等多种生物活性。本文以吉安地区生长的古桑树桑叶为试验材料，分析测定其桑叶中的总酚、总黄酮、DNJ和多酚单体的含量，以期为功能性成分桑品种的选育和品种评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料的基本情况

根据北京古树名木评价标准(DB11/T478-2007)，胸径≥100，分级级别为一级，胸径≥50cm，分级级别为二级。

供试桑品种均采自于江西省吉安地区，其性状见表1。由表1可知，试验桑树的样品均为古桑树，其中叶1号树为一级，其它为二级。

表1 吉安地区古桑基本性状调查表

1.2 试验方法与设备

新鲜桑叶于60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛，备用。测定时准确称取一定重量，重复取3次，用于桑叶活性成分含量测定。

设备：Agilent 1260高效液相色谱(美国安捷伦科技公司)、722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.3 检测方法

1.3.1 总酚含量测定

称取不同古桑桑叶样品，置50mL离心管中，加80%乙醇30mL，超声提取3次，每次30min。10 000rpm离心5min，合并提取液，过滤并转入100mL容量瓶中，以80%乙醇定容，即得待测桑叶总酚的供试品。测定方法采用福林-肖卡法[7～8]，以没食子酸标准品作标准曲线计算总酚类物质的含量。

1.3.2 总黄酮含量测定

提取方法同1.3.1。测定方法采用亚硝酸钠-硝酸铝法，以芦丁为标准曲线计算总黄酮含量[2]。

1.3.3 DNJ含量测定

称取0.1g干燥至恒重的桑叶粉末，精密称定，于10mL的离心管中，加0.05mol/L的盐酸溶液10mL，涡旋提取3min，离心15min(转速12 000r/min)，取上清液，残渣加0.05mol/L的盐酸溶液10mL,同法重复提取一次，离心，合并2次提取液并转移至50mL容量瓶，蒸馏水定容即得待测的供试品。

准确称取20mgDNJ标准品于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容，即得0.8g/L的DNJ标准溶液，稀释至质量浓度为60μg/mL、120μg/mL、180μg/mL、240μg/mL、300μg/mL、480μg/mL备用。以DNJ的质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，得DNJ的标准曲线线性回归方程。

取DNJ提取液(或DNJ标准液)100μL，再加入5mmol/L的FMOC-Cl(溶解于乙腈中)200μL，混匀后于25℃水浴20min。加入1mol/L甘氨酸100μL中和剩余的FMOC-Cl以终止反应，加入1%醋酸100μL及超纯水400μL，以0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液备测。空白对照以蒸馏水代替DNJ提取液进行衍生化反应。

色谱条件：色谱柱C18柱(150mm×4.6mm×5μm)；荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm；流动相为乙腈-0.1%醋酸(体积比50:50)；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL。

1.3.4 多酚单体含量测定

提取方法同1.3.1。色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A-乙腈、B-0.4%冰醋酸，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。梯度洗脱程序：B泵在0～40min时，95%降至75%；在40～45min时，由75%降至65%；在45～50min时，由65%降至50%[9]。

标准曲线制备：准确称取绿原酸、芦丁、槲皮素和龙胆酸标样各0.0100g，用纯甲醇定容至10mL，4℃保存备测。

2 结果与分析

2.1 不同古桑树桑叶中总酚含量的变化

根据实验方法制作标准曲线，回归方程式 y =3.7434x+0.0525，R2=0.9973，表明没食子酸质量浓度为0.02～0.2mg/mL范围内与其吸光值呈现良好的线性关系，符合朗伯比尔定律，该方程可用于桑叶总酚的定量测定。不同桑叶总酚含量的测定结果见图1，由图1可知不同桑叶总酚含量存在差异，叶2和叶3差异不显著(p>0.05)，叶1、叶4、叶5和叶6差异极显著(p<0.01)，其中叶6中总酚含量最高，均值高达18.31mg/g，叶4次之，均值为17.39mg/g，叶2含量最低，均值为13.16mg/g。

图1 不同古桑树桑叶中总酚含量的变化

2.2 不同古桑树桑叶中总黄酮含量的变化

根据实验方法制作标准曲线，回归方程式 y =1.4586x-0.0167，R2=0.999，表明芦丁质量浓度为0.1 ～0.6mg/mL范围内与其吸光值呈现良好的线性关系，符合朗伯比尔定律，该方程可用于桑叶总黄酮的定量测定。不同桑叶总黄酮含量的测定结果见

图2，由图2可知不同桑叶总黄酮含量存在差异，叶1、叶2和叶5差异不显著(p>0.05)，叶3、叶4和叶6差异极显著(p<0.01)，其中叶4中总黄酮含量最高，均值高达35.24mg/g，叶6次之，均值为31.68mg/g，叶3含量最低，均值为25.59mg/g。

图2 不同古桑树桑叶中总黄酮含量的变化

2.3 不同古桑树桑叶中DNJ含量的变化

根据实验方法制作标准曲线，回归方程式 y =0.1557x+1.8258，R2=0.9952，x轴代表峰面积，y轴代表浓度，表明DNJ质量浓度为11.2 ～56μg/mL范围内与其峰面积呈现良好的线性关系，符合朗伯比尔定律，该方程可用于桑叶DNJ的定量测定。不同古桑树桑叶DNJ含量的测定结果见图3，由图3可知，品种不同DNJ含量存在很大的差异。叶1样的DNJ含量最高，高达8.63mg/g，是叶5样的10倍。从DNJ含量角度考虑，可以把叶1样株作为特殊种质资源加以保存。

图3 不同古桑树桑叶中DNJ含量的变化

2.4 不同古桑树桑叶中多酚单体含量的变化

2.4.1液相色谱标准曲线的制备

在确定的色谱条件下测定不同质量浓度的标准品混合液，以各梯度质量浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，得到各类多酚单体的回归方程(表1)。各标样质量浓度与峰面积的相关性良好，相关系数(R2)在0.9994以上。

2.4.2 不同古桑树桑叶中多酚单体物质色谱图

不同古桑树桑叶中多酚单体色谱图见图4。由图4可以看出，不同古桑树桑叶中多酚单体物质得到了较好的分离，且图谱相似，共有峰较多。

2.4.3 不同古桑树桑叶中多酚单体物质含量变化

不同古桑树桑叶多酚单体含量的变化见表2。由表2可知，叶6中绿原酸含量最高，为11.47mg/g，不同古桑树桑叶之间绿原酸含量大小关系：叶6>叶4>叶5>叶1>叶2>叶3；叶5中芦丁含量最高，为1.99mg/g，不同古桑树桑叶之间芦丁含量的高低关系：叶5>叶6>叶4>叶1>叶3>叶2；叶6中槲皮素含量最高，为0.60mg/g，不同古桑树桑叶之间槲皮素含量高低关系：叶6>叶4>叶5>叶1>叶2>叶3；叶6中龙胆酸含量最高，为2.12mg/g，不同古桑树桑叶之间龙胆酸含量顺序：叶6>叶4>叶5>叶1>叶3>叶2。综合来看叶6中多酚单体含量相对较高。

表1 4种多酚单体物质的标准曲线

表2 不同古桑树桑叶中多酚单体物质含量变化

图4 不同古桑树桑叶中多酚单体液相色谱图

3 小结与讨论

通过对6株古桑树桑叶总黄酮含量进行测定，发现不同株的古桑树桑叶总黄酮含量差异显著。不同地方、不同树龄的古桑树，其桑叶多酚含量存在差异，有的还达到极显著水平。不同株的古桑树桑叶DNJ含量也存在很大的差异，叶1样的DNJ含量最高，高达8.63mg/g，是叶5样的10倍。从DNJ含量角度考虑，可以把叶1号样株作为特殊种质资源加以保存。

不同桑叶营养成分含量上的差异除了受本身遗传和生理特性影响外，还受栽培地区气候、土壤和栽培条件的影响，桑叶作为一种药食两用的植物，评价其营养品质好坏的指标有很多，包括蛋白、脂肪、多糖、总酸、纤维、多酚、黄酮等，但根据其用途的不同，营养评价指标也有所不同。因而在营养评价上要有选择性，做到有的放矢，物尽其用[10]。

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