鼠曲草和芦荟黄嘌呤氧化酶抑制活性的研究

黄真池 李 恒

(岭南师范学院 生命科学与技术学院，广东 湛江 524048)

痛风是嘌呤代谢紊乱，导致尿酸在体内蓄积，引起高尿酸血症和尿酸盐结晶沉积所致的特征性急性关节炎，并引发尿酸盐肾病，尿路结石等，严重者可出现关节致残[1].另外，痛风还与高血压、肾脏疾病、高血脂症、糖尿病和心脑血管疾病等多种代谢紊乱综合征有关.黄嘌呤氧化酶( Xanthine Oxidase，XOD) 是嘌呤代谢中的关键酶，能催化嘌呤氧化生成尿酸，同时产生超氧阴离子自由基[2].抑制黄嘌呤氧化酶的活性可以从根本上减少尿酸生成，并减轻自由基造成的组织伤害[3].目前临床上治疗痛风的主要化学药物是别嘌呤醇，主要通过抑制XOD的活性控制尿酸生成，但使用别嘌呤醇常伴有发热、腹痛、白细胞及血小板减少，肝功能损害等严重副反应，影响其在临床中的使用[4,5].来源于中草药的天然产物可作为黄嘌呤氧化酶的抑制剂，低毒较安全，不易引起人体过敏反应且来源广泛[6,7].随着人们对中草药降尿酸作用的研究，多种中药材被证实具有一定的降尿酸功效.

酸立通降酸茶是一种袋泡茶产品，主要中药成分为鼠曲草和西洋参，厂家声称其是天然产物来源的中药茶，有显著抑制尿酸合成、防治痛风的功效.鼠曲草(GnaphaliumaffineD. Don)又名白艾、清明菜，菊科鼠曲草属植物，以野生为主，具有光防护、抑菌抗炎、保肝等作用，也可食用，是天然的药食资源.据报道，黄酮类成分为鼠曲草属植物中抗炎、抗氧化作用的主要活性成分[8].芦荟(Aloevera)为百合科多年生常绿草本植物，原产于地中海、非洲，现在几乎遍及世界各地.芦荟是集食用、药用、美容、观赏于一身的植物新星，芦荟中主要含有槲皮素和芦丁等黄酮类物质[9].

目前痛风症已被联合国列为21世纪20大顽症之一[10].从天然中草药中寻找安全无毒副作用的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有实际意义[11].本试验以别嘌呤醇为阳性对照，比较酸立通降酸茶、鼠曲草、芦荟对XOD的抑制作用.并用AB-8大孔树脂对样品进行分离纯化，分析其有效成分的活性，为降尿酸产品的研究开发及消费者的使用提供参考.

1 材料和方法

1.1 材料

鼠曲草(GnaphaliumaffineD. Don)，购于安徽诚信药家有限公司.芦荟(Aloevera)，新鲜3年生美国芦荟肉质叶.酸立通鼠曲草袋泡茶(降酸茶),购于多尔顿药业公司.

1.2 方法

1.2.1 样品制备

酸立通降酸茶：取一包袋泡茶(4 g)，用300 mL100 ℃开水冲泡10 min，室温下静置，冷却备用.鼠曲草煎煮液：取鼠曲草干草100 g，洗净后置于900 mL水中浸泡30分钟，加热煎煮浓缩至300 min，将煎煮所得液体真空抽滤，室温下静置，冷却备用.鼠曲草提取液：取鼠曲草干草100 g，洗净剪碎后研粉，加入95%乙醇300mL提取，置于电热恒温水浴锅浸泡2 d，温度60 ℃，真空抽滤，取上清液，回收滤渣进行2次提取，溶剂用量和提取时间都减半，合并2次的提取滤液，静置2 h.提取液用旋转蒸发器回收溶剂,剩余300 mL样品, 得到鼠曲草提取液.芦荟煎煮液：取新鲜完好的芦荟叶，洗净，沥干, 切薄片置于50 ℃烘箱内烘干至恒重，研粉置于保鲜袋中保存备用.称取100 g干粉洗净后置900 mL水中浸泡30 min，加热煎煮浓缩至300 mL，将煎煮所得液体真空抽滤，室温下静置，冷却备用.芦荟提取液：称取100 g芦荟干粉，同上制备鼠曲草提取液的方法.

1.2.2 尿酸生成量测定

采用分光光度法测定单位时间内在294 nm波长下尿酸的生成量，从而测定各样品酶活力的大小.体外对XOD的抑制实验方法参考 Umamahesari[13]等方法.反应体系为3mL，黄嘌呤底物浓度为0.6 mmol/L，黄嘌呤氧化酶的浓度为0.2 U/mL，磷酸缓冲液pH7.5，别嘌呤醇液浓度为30 μg/mL，中草药样品液0.2 mL.每个样品均作3次生物学重复.

1.2.3 NBT显色反应

蓝色甲腙在560 nm处有最大吸收峰，用分光光度计测定其在560 nm处的吸光度，进一步判断各样品对XOD活性的影响.反应体系为3.5 mL，黄嘌呤底物溶液浓度为0.6 mmol/L，黄嘌呤氧化酶的浓度为0.2 U/mL，磷酸缓冲液pH7.5，NBT浓度为0.6 mmol/L，30 μg/mL别嘌呤醇液，各中草药样品液0.2 mL.每个样品均作3次生物学重复.各样品对黄嘌呤氧化酶的抑制率的计算参考文献[15]的公式.

1.2.4 超氧阴离子清除能力检测

检测按参考文献[16]的方法.反应体系为3 mL，黄嘌呤底物溶液终浓度为0.6 mmol/L，黄嘌呤氧化酶的终浓度为0.2 U/mL，磷酸缓冲液pH 7.5，NBT浓度为0.6 mmol/L，30 μg/mL别嘌呤醇液，各中草药样品液0.2 mL.每个样品均作3次生物学重复.超氧阴离子清除率计算参考文献[17] 的公式.

1.2.5 AB-8大孔吸附树脂纯化样品

称取AB-8大孔吸附树脂100 g于95% 乙醇中浸泡2d，用大量蒸馏水洗至无醇，再用5% HCl溶液浸泡3 h，用蒸馏水洗至流出液pH 为中性，再用2% NaOH溶液浸泡3 h，蒸馏水洗，取处理过的树脂6.0 g，进行湿法装柱于层析柱(1.2 cm×80 cm)，洗脱剂为60%乙醇溶液[18].每6 mL收集一管流出液，测定其在510 nm 处的OD值，以OD值为纵坐标，管数为横坐标绘制洗脱曲线.

2 结果与分析

图1 各样品对XOD的抑制率(尿酸生成量测定)

2.1 酸立通降酸茶与鼠曲草煎煮液对黄嘌呤氧化酶的抑制比较

别嘌呤醇、酸立通降酸茶、鼠曲草煎煮液对XOD 的抑制率分别为61.1%、39.4%、16.2%(图1).酸立通降酸茶比鼠曲草煎煮液对XOD 的抑制作用更为明显，二者差异达显著水平(P< 0.01).

2.2 酸立通降酸茶与鼠曲草煎煮液的NBT显色反应

通过测定超氧阴离子生成量可计算样品对XOD的抑制率.鼠曲草煎煮液对XOD活力的抑制率最显著，为78.7%，而酸立通降酸茶对XOD活力的抑制率仅为6.9%(图2)，显著低于鼠曲草煎煮液对XOD活力的抑制率(P<0.01).这一结果与尿酸生成量实验的结果(图1)相悖，据此推测鼠曲草煎煮液可能具有较强的超氧阴离子清除能力.

图2 样品对XOD 的抑制率(NBT显色反应)

2.3 酸立通降酸茶与鼠曲草煎煮液对超氧阴离子的清除能力测定

图3 各样品对超氧阴离子清除活性对比图(a1，a2：鼠曲草；b1，b2：酸立通；c1，c2：对照)

用NBT显色后，鼠曲草测定组的颜色明显浅于对照组(图3)，说明其对超氧阴离子具有较强的清除能力.计算结果，鼠曲草煎煮液超氧阴离子清除率达75.5%，而酸立通降酸茶对反应体系中超氧阴离子的清除率只有12.2%.进一步证明鼠曲草煎煮液对超氧阴离子具有较强的清除作用.

2.4 鼠曲草与芦荟的煎煮液、提取液对XOD的抑制比较

别嘌呤醇、鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液对XOD 的抑制率分别为54.3%、16.4%、47.5%、23.4%、27.6%(图4)，抑制率大到小依次为：鼠曲草提取液>芦荟提取液>芦荟煎煮液>鼠曲草煎煮液.鼠曲草、芦荟的提取液相比其煎煮液对XOD 的抑制作用更为明显.同一样品中，鼠曲草提取液和鼠曲草煎煮对XOD 抑制作用的差异达显著水平(P<0.01).

图4 各样品对XOD 的抑制率(尿酸生成量测定)

2.5 鼠曲草与芦荟的煎煮液、提取液NBT显色反应

NBT显色反应结果如图5所示：别嘌呤醇、鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液对XOD 的抑制率分别为30.4%、79.2%、53.1%、88.4%、28.5%.鼠曲草、芦荟的煎煮液相比提取液对XOD 的抑制作用更明显.结合图3和图4结果，再次证明了鼠曲草煎煮液对超氧阴离子确实具有较强的清除作用；鼠曲草提取液对XOD的抑制率也达到了53.1%，说明其除了对黄嘌呤氧化酶有抑制作用之外, 还有直接清除自由基的作用.芦荟煎煮液对超氧阴离子也有较强的清除活性.

图5 各样品对XOD 的抑制率(NBT显色反应)

2.6 AB-8大孔吸附树脂对各样品的分离纯化

图6 AB-8大孔树脂纯化样品的洗脱曲线

芦荟和鼠曲草富含黄酮且活性成分主要是黄酮类化合物.层析洗脱结果如图6所示：鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液洗脱曲线都有一个明显的主峰.说明AB-8大孔树脂对于鼠曲草、芦荟草黄酮的吸附率和解吸率都较高，其中鼠曲草提取液洗脱的峰形较为对称且尖，洗脱分离效果最好.

2.7 鼠曲草、芦荟纯化组分黄嘌呤氧化酶抑制活性

鼠曲草、芦荟纯化组分影响尿酸生成量结果如图7：别嘌呤醇、鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液对XOD 的抑制率分别为23.1%、3.0%、18.8%、5.2%、14.4%.以别嘌呤醇抑制率为对照，分离纯化后样品的抑制率大到小依次为：鼠曲草提取液>芦荟提取液>芦荟煎煮液>鼠曲草煎煮液，这与分离纯化前的各样品抑制率大小排序相同.分离纯化后的鼠曲草、芦荟提取液相比其煎煮液对XOD 的抑制作用更加明显；结合图6结果，证实芦荟和鼠曲草煎煮液、提取液中的黄酮类物质是XOD的主要抑制物.

图7 各样品对XOD 的抑制率(尿酸生成量测定)

3 讨 论

本研究以别嘌呤醇为阳性对照，通过尿酸生成法和NBT法比较了酸立通降酸茶、鼠曲草和芦荟对XOD的抑制效果.酸立通降酸茶、鼠曲草提取液和煎煮液、芦荟提取液和煎煮液都表现出较强的XOD抑制活性.但是尿酸生成法和NBT法检测结果差异明显.通过采用核黄素-甲硫氨酸光照法发现，鼠曲草和芦荟煎煮液清除超氧阴离子的能力较强，造成尿酸检测法和NBT法的结果相悖的原因在于鼠曲草和芦荟煎煮液能高效地清除超氧阴离子.经AB-8大孔树脂层析洗脱，鼠曲草煎煮液、鼠曲草提取液、芦荟煎煮液、芦荟提取液洗脱曲线在510 nm处都有一个明显的主峰，说明芦荟和鼠曲草对XOD的抑制主要来自黄酮类化合物.

本研究改良核黄素-甲硫氨酸光照法检测鼠曲草和芦荟黄嘌呤氧化酶抑制活性，排除了黄嘌呤、样品液和酶液等对光吸收值的干扰，方法专属性强、重复性较好，可供筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂时应用.

研究发现，鼠曲草和芦荟都具有双重功效，既能抑制XOD的的活性，又能高效地清除超氧阴离子，其中鼠曲草提取液抑制XOD效果最明显，接近别嘌呤醇的水平.鼠曲草和芦荟来源广泛、成本低廉、制备方法简单.以鼠曲草、芦荟为原料有望研发出既能降尿酸又能抗衰老的保健药物.

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