猪-猴肝移植中的凝血调节障碍问题

2018-01-29 20:23:31张玄李霄王权成张虹白鸽陶开山窦科峰空军军医大学西京医院肝胆外科全军器官移植研究所陕西西安710032

实用器官移植电子杂志 2018年5期

张玄，李霄，王权成，张虹，白鸽，陶开山，窦科峰（空军军医大学西京医院肝胆外科，全军器官移植研究所，陕西西安 710032）

异种器官移植是未来解决同种器官短缺的有效途径之一，而猪被认为是最佳异种器官供体。随着α-1，3-半乳糖转移酶敲除（α-1，3-galactosyltransferase gene knockout，GTKO）猪的逐渐人源化改造，以及新型共刺激信号阻断剂进入临床前试验阶段，异种移植的免疫学屏障正不断被攻克，临床异种器官移植已经离我们越来越近。

与心脏、肾脏移植相比，异种肝移植不仅存在免疫排斥反应，更为严重的是受体凝血功能调节障碍，约90%的受体会出现血循环中血小板急剧减少，引发致死性出血。因此，受体的存活时间十分有限（目前的记录为29天［1］），远远无法满足临床需求。这和肝脏本身生理功能复杂，有严重的“生理不兼容”等问题有关。本文将针对异种肝移植中存在的凝血调节障碍，围绕移植过程中出现的血小板激活、聚集和吞噬等免疫生物学问题，特别是血小板和肝血窦内皮细胞、肝细胞及库普弗（Kupffer）细胞之间的相互作用进行论述。

1 猪-猴肝移植时出现严重的凝血功能紊乱

最早报道猪-非人灵长类异种肝移植术后会出现严重血小板减少和不可控制出血现象的是Calne教授团队［2］。研究显示，这类凝血障碍并不是独立出现的，往往伴随着超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）的发生，这可能与移植中普遍使用野生型猪的肝脏有关。移植肝脏免疫组织化学会有明显的IgG、IgM、C3、C4d和C5b-9沉积，同时可观察到血小板严重减少，急性出血性凝固性坏死、可能的梗死和纤维蛋白血栓［3］。2000年，Ramírez等［4］使用转人 CD55分子（decay accelerating factor，DAF）的基因修饰猪进行异种肝移植后，2只狒狒分别活了4天和8天。2例移植肝脏均未观察到明显的HAR发生，但在术后第1天即发生血小板严重丢失，同时伴有显著纤维蛋白原减少和D-二聚体升高，提示出现消耗性凝血功能障碍。在后续转入人CD59分子和H-transferase后也得到类似结果，受体存活时间均小于24小时［5］。

2012年，匹兹堡的研究团队率先进行了GTKO猪-狒狒异种肝移植尝试，结果发现，GTKO或GTKO/hCD46猪肝脏配合临床级别的免疫抑制治疗，受体的存活时间可延长到7天，但仍会死于严重的血小板减少导致的多组织、器官的自发性出血［3，6］。研究显示，血小板减少一般发生在肝移植术后1小时，有报道称狗-猪异种肝移植术后15分钟即可观察到血小板减少［7］，但移植肝功能相对正常，可检测到猪源凝血因子和白蛋白的表达［8］。组织活检未发现有明显的HAR或急性体液、细胞性排斥反应的发生。免疫组化提示移植肝中有轻度的IgM沉积，未见IgG、C3、C4d及C5b-9沉积和T、B淋巴细胞浸润。共聚焦显微镜和电镜证实移植肝血窦有大量血小板聚集、血小板-纤维蛋白混合血栓形成及单核/巨噬细胞边缘浸润现象［3］。

有学者加强了GTKO猪-狒狒肝移植中免疫抑制治疗，可延长受体存活时间到9天。此例实验中，氨基己酸（赖氨酸的衍生物和类似物，赖氨酸质粒结合位点的有效抑制剂，从而阻断纤维蛋白溶解）的使用大大缓解了血小板丢失。虽然血小板的减少临近界值（血小板计数维持在40 000～50 000/mm3），狒狒仍出现严重的出血现象，并最终死于脓毒血症［9］。

2013年，空军军医大学西京医院窦科峰教授团队在国际上首次尝试了GTKO猪-藏酋猴脾窝辅助性肝移植研究。实验过程中，受体的脾脏被切除，部分供体肝脏（约120 g）被植入脾窝，术后受体存活时间延长至14天。组织学染色证实移植肝中有一定程度的血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy，TMA）形成，但术后严重血小板丢失现象并未出现，其计数始终维持在50 000/mm3以上的水平。

2 猪-猴肝移植凝血功能紊乱病理特征

猪-猴肝移植时受体的凝血系统被显著激活，而猪肝目前缺乏足够的凝血调节能力，最终引发受体凝血紊乱。其主要病理特征为：TMA和（或）播散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）形成。这两者均可发展为血小板减少症、微血管性溶血性贫血和微血管血栓，最终导致器官缺血、梗塞和功能障碍。研究认为，这与猪内皮细胞的激活损伤相关，搞体和补体介导的内皮激活使内皮细胞由搞凝状态转变为促凝状态。猪源性组织因子（tissue factor，TF）和受体TF的释放会迅速启动外源性凝血系统。同时，损伤的内皮和暴露的内皮下组织会协同补体系统，共同激活血小板，导致其聚集、黏附和消耗。

多项研究表明，异种肝移植术后的凝血紊乱是一个多因素、多途径共同作用的结果，多种机制均参与其中。单一的处理，如清除天然搞体、中和受体补体等并不能完全阻止其发生［10］。

3 丢失血小板的去向：聚集、激活或吞噬？

众所周知，血小板是血管化器官移植存活的重要因素，其通过分泌多种趋化因子和表达相关受体的配体，如：MIP-1α、 RANTES、 MCP-3和PF4等，影响着单核/巨噬细胞、T细胞和血管内皮细胞的交互作用。当巨噬细胞、T细胞和激活的血小板一起定位到血管，通过受体与配体结合，细胞间的交互作用即开始发生。激活的血小板表达P-选择素和CD40L（CD154）。巨噬细胞表达PSGL-1、CD40和MAC-1。除了CD40，巨噬细胞表面的MAC-1也可以和血小板、T细胞表面表达的 CD154 相结合［11］。

为了更好地研究异种肝移植中血小板聚集、激活或吞噬的相关问题，许多研究小组建立了猪-非人灵长类的体外研究模型。或采用人血或狒狒的血液建立循环灌注系统来体外灌注猪的肝脏［12］。或直接分离肝血窦内皮细胞和Kupffer细胞进行体外细胞实验［13］。

3.1 体内肝移植研究：匹兹堡的研究小组采用流式检测分析了GTKO.hCD46供肝移植给狒狒后，受体血细胞-白细胞的黏附聚集情况［6］。研究发现，严重血小板减少症的进展和血小板自身以及血细胞-白细胞（尤其是单核细胞）的黏附聚集有关。尽管在整个实验过程中，平均血小板体积保持稳定，但在移植后的第1小时内血小板计数即出现明显下降。移植后2小时的组织活检证实，移植肝中有血小板和纤维蛋白的沉积。研究认为，移植后早期受体血循环中血小板的丢失，部分是由于血小板自身以及血细胞-白细胞之间的黏附聚集造成的，这也是外周血的血小板计数偏低的原因。血小板在血液、移植肝以及可能在受体肺组织中的聚集均使其无法发挥正常生理功能，引起自发性出血［14］。通过共聚焦显微镜和电镜可观察到肝血窦中血小板的聚集，并伴有外周血单核细胞和纤维蛋白［15］。

他们也同时观察到肝血窦内皮细胞的激活和循环血小板及外周血单个核细胞的变化。其中，内皮细胞的激活分两种类型，Ⅰ型激活由配体结合到G蛋白偶联受体的胞外段介导，引起P-选择素的表达和血管中血浆蛋白的渗出，这个过程需要10 ～ 20分钟［16］。Ⅱ型激活由肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）刺激后诱发，通过合成黏附蛋白如：E-选择素和CD106，增加白细胞的募集，这个过程维持6 ～ 24小时［17］。Ⅰ型和Ⅱ型激活被认为分别与HAR和急性体液性异种移植排斥反应（acute humoral xenografi rejection，AHXR）有关［18］。激活的内皮细胞和生成的凝血酶进一步激活血小板、白细胞和其他的炎性细胞，形成恶性循环。

研究发现，肝移植后2小时，循环血小板及外周血单个核细胞就已经被激活，并开始分泌组织因子CD142。血小板和内皮细胞微粒检测提示血浆中的微粒来源于血小板，呈TF（CD142）阳性。搞猪CD31分子染色提示实验过程中只有少量的猪内皮细胞被激活。同时，通过免疫荧光检测Ⅰ型（P-selectin）和Ⅱ型（E-selectin、CD106）内皮激活，以及TF、von Willebrand因子（vWF）表达，发现Ⅰ型和Ⅱ型内皮激活的分子标志以及CD142分子的表达在术后2小时即显著降低，但在死亡观察终点时（4 ～ 7天）仍可见其有表达。组织活检显示vWF移植前为阴性，移植后2小时呈阳性，这提示猪源vWF激活了狒狒的血小板［15］，此结果和Schulte等［19］的报道一致。

Tector等［7］也观察到血小板的激活和在受体肺组织中的聚集。不论是否有出血现象，受体自身肺组织的血小板染色均呈阳性。但是，受体其他器官（心、肾、小肠和淋巴结）只有在出现大量间质出血时，血小板染色才呈阳性［3］。

3.2 离体血液灌注研究：印第安纳波利斯的研究小组使用人血对野生型猪的肝脏进行离体灌注，并在灌注过程的不同时间点（灌注前和灌注15、30、45、90和120分钟）分别取肝组织活检。他们发现肝血窦内皮细胞和肝细胞在灌注后15分钟即开始吞噬人的血小板［12］。马里兰的实验组曾尝试是否能延缓血小板减少症的进展，他们利用全身肝素化的狒狒和GTKO.hCD46的猪肝脏建立了体外循环灌注系统。针对glycoprotein receptor（GP）IbvWF信号通路，灌注前对供猪给予去氨加压素清除vWF，并在开始灌注时和灌注后30分钟对受体给予anti-GPIb搞体，他们成功将血小板减少症延缓至灌注后3小时［20］。

作为肝移植的替代选择，有研究组建议用猪肝作离体灌注来“桥接”同种肝移植。Rees等［21］用人血灌注猪肝15分钟即发现血小板计数降至30 000/mm3以下，并伴有红细胞的丢失。在使用野生型猪和hCD55转基因猪的肝脏进行相同的体外灌注72小时后，可观察到等量的（3 units）人血红细胞被消耗，这种针对人红细胞的移植物搞宿主反应并不是由经典的补体激活溶解途径引起，而是由肝脏中的Kupffer细胞吞噬造成的，并且这种吞噬和调理作用无关［22-23］。

Burlak等［24］认为猪 Kupffer细胞识别人红细胞是依赖人红细胞表面的N-乙酰神经氨酸（N-Acetylneuraminic Acid，NANA，Neu5Ac，唾液酸的一种类型）的表达。在体外细胞实验中，使用Neu5Ac预处理Kupffer细胞后，其对红细胞的结合明显减少。这项研究说明去除人红细胞表面的唾液酸表达可完全废除Kupffer细胞介导的吞噬效应。

了解到人红细胞表面的低聚糖是导致猪巨噬细胞与人红细胞相互作用的原因后，Brock等［25］鉴定了猪巨噬细胞表面可能参与此作用的植物凝集素。唾液酸黏附素（sialoadhesin，CD169）被认为介导了猪巨噬细胞和人红细胞表面Neu5Ac的结合。此外，体外实验证实使用搞猪CD169单克隆搞体预处理猪的Kupffer细胞可降低其与人红细胞的结合率，达到和同种移植相同的水平。Waldman等［26］也利用分离的人红细胞灌注野生型猪的肝脏72小时，同时使用搞猪CD169单克隆搞体，发现红细胞的破坏明显减少，肝功能也得到改善。

3.3 体外细胞干预研究：肝脏是补体蛋白的合成位点，除外C1q、D因子及备解素和C7。异种肝移植后，移植物将合成猪源补体蛋白。猪补体不会对移植肝造成损伤，特别是在GTKO猪表达hCD46分子或其他人补体调节蛋白的情况下。匹兹堡的研究小组证实［27］，相对于人补体，猪补体对移植肝的损伤小得多。异种肝移植后，总体的补体活性基本保持稳定或有所升高。他们还证实，GTKO.hCD46猪来源的外周血单个核细胞会发生较少的补体或搞体介导的溶细胞效应。

在体外灌注实验中证实了血小板是被猪肝血窦内皮细胞、Kupffer细胞和肝细胞吞噬之后，印第安纳波利斯的研究团队进一步探索了引起血小板减少的受体-配体相互作用。他们将注意力放在了脱唾液酸糖蛋白受体-1（asialoglycoprotein receptor-1，ASGR1）的作用上，该蛋白参与了血小板的清除过程。分别分离野生型和GTKO.hCD55猪的肝血窦内皮细胞和带有荧光标记的人血小板进行共培养，发现ASGR1与血小板吞噬产生共定位，使用去唾液酸糖蛋白和ASGR1特异性搞体可抑制血小板的结合和吞噬，并呈剂量依赖性。同时，使用siRNA降低肝血窦内皮细胞ASGR1的表达，血小板的吞噬效率会降低21%～31%左右［28］。

Kupffer细胞是肝脏巨噬细胞，同样参与了血小板的吞噬过程。CD11b/CD18（MAC-1）是和吞噬相关的受体。印第安纳波利斯课题组研究了CD11b/CD18在野生型和GTKO.hCD55猪源Kupffer细胞吞噬人血小板过程中的作用［29］。当吞噬发生时，CD18和血小板产生共定位，搞CD18单克隆搞体可抑制这种吞噬作用，在野生型和GTKO.hCD55型Kupffer细胞中的抑制效率分别为43%～73%和18%～55%。波士顿的研究小组通过分离野生型和GTKO猪的肝细胞和肝血窦内皮细胞，探索了整合素依赖的狒狒血小板的激活和吞噬，他们发现猪源肝血窦内皮细胞对猪的血小板不发生吞噬作用，但是会对狒狒的血小板发生强烈的吞噬效应。虽然猪源肝血窦内皮细胞和主动脉内皮细胞均吞噬狒狒血小板（肝血窦内皮的吞噬作用更强），但体外未发现猪肝细胞对血小板的吞噬作用［30］。有研究发现，人类血小板Galβ和βGlcNAc半乳糖的暴露程度是新鲜猪血小板的4倍，Galβ和βGlcNAc在猪血小板上不被唾液酸所掩盖，从人类血小板中去除唾液酸会增加肝血窦内皮细胞和Kupffer细胞的结合和吞噬作用［13］。

4 凝血障碍相关干预方案

4.1 信号调节蛋白α（signal regulatory protein-α，SIRPα）-CD47：肝脏巨噬细胞（Kupffer细胞）和肝血窦内皮细胞表达SIRPα，它能使细胞分清自我和非我从而调控吞噬作用。CD47是SIRPα识别自我的蛋白分子，在红细胞和血小板上均有表达，正常情况下，SIRPα-CD47的相互作用可以防止吞噬。研究表明人SIRPα可和猪CD47分子结合，甚至表现出更高的亲和力，但却无法发挥出抑制吞噬的作用。猪SIRPα和人CD47分子之间也存在种属不兼容问题，两者相互作用不能抑制猪源细胞对人血小板的吞噬。尽管理想的基因改造方法是使猪的肝脏表达人SIRPα，但是人SIRPα和猪CD47分子的亲和力远高于人CD47，无法产生抑制酪氨酸磷酸化的信号。同时，人SIRPα和内源猪SIRPα之间还会产生竞争关系，使情况变得更为复杂［31］。

SIRPα不仅表达在肝脏内皮细胞和Kupffer细胞，循环巨噬细胞同样有表达，因此，循环巨噬细胞同样需要内皮或其他细胞提供CD47信号来防止被激活。Zhang等［32］和Tena等［33］分别报道繁育出导入人CD47的小型猪，但是进行异种肝移植后的结果却不尽如人意。这可能与CD47介导炎症反应和增强血管收缩功能有关，因此，CD47的过表达对移植物本身可能是有害的。此外，CD47还是血小板反应素-1（thrombospondin-1，TSP-1）的受体，而TSP-1在血小板聚集和血栓形成中发挥重要作用［34］。

4.2 血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）：猪的血栓调节蛋白很难激活人凝血酶，导致活化型的人蛋白C（active protein C，aPC）生成减少。目前世界上已有许多研究成功培育出表达人源TM（hTM）的小型猪。已有的体外证据和转基因小鼠实验表明，hTM的表达对调节异种移植过程中的凝血功能障碍和炎症有益［35］。目前，匹兹堡的研究团队利用GTKO/hCD46/hTM和GTKO/hCD55/hCD59/hCD39/hTM两种类型的转基因猪，在异种心脏移植中证实，导入hTM可以维持血小板和纤维蛋白原的稳定，血小板的激活明显减弱，消耗性凝血障碍得到缓解。尽管这些体内研究结果非常鼓舞人心，为跨物种不兼容相关凝血障碍提供了可能的解决途径，但是，在此基础上再导入内皮细胞蛋白C受体可能效果会更显著。

4.3 组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）：TF 又称为血小板组织因子（platelet tissue factor）、因子Ⅲ和CD142，在内皮下组织和白细胞均有表达，在凝血过程中的作用是启动外源性凝血途径，促进血栓生成。TFPI是一种单链多肽，它可以可逆地抑制因子Xa（FXa）。当FXa被抑制时，FXa-TFPI复合体也可以抑制FⅦa-TF复合体，抑制外源性凝血过程。生理情况下，TF和TFPI两者处于动态平衡。早期的证据证实猪的TFPI和人的FXa不兼容，然而，后来有体外研究证实，合适糖基化修饰的重组猪源TFPI和人TF途径没有明显的不兼容现象。最近，西安的窦科峰教授课题组在猪的骨髓间充质干细胞中导入人的TFPI，发现其能够通过人TF途径调节凝血异常［36］。另外，猪的内皮细胞表达人TFPI是有益的，因为TFPI会迅速地由炎性血管内皮脱落。目前，世界上仅培育出胰腺特异性表达TFPI的小型猪，对于肝脏而言，将来TFPI的表达最好局限在血管内皮细胞，因为TFPI的过表达可能对猪的存活不利。

4.4 三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1（CD39）/胞外核苷酸酶（CD73）：膜外CD39分子参与了ATPADP-AMP的分解过程。CD73分子负责催化AMP水解成腺苷（一种搞血栓和心血管保护的介质）。Dwyer等最早报道，在小鼠中转入人的CD39（hCD39）分子可以使其血小板聚集功能受损，延长出血时间，减少系统性血栓栓塞的发生［37］。Wheeler等［38］的研究表明，在猪中导入 hCD39 分子，发现能明显保护心肌。有研究显示，敲除CD73分子对体内血栓形成影响很小，但是增加造血来源细胞表面CD39分子的表达（特别是单核细胞），会明显延缓动脉血栓形成［39］。在猪到非人灵长类的异种肾移植大动物研究中，GTKO/ hCD55/hCD59/hCD39的转基因猪并没有带来令人鼓舞的结果［40］。

4.5 von Willebrand因子（vWF）：猪vWF可以激活受体狒狒的血小板，有证据表明，敲除猪vWF后需要同时导入人vWF，因为vWF敲除猪有出血倾向。但是，由于vWF基因复杂且定位较宽，使猪表达人vWF是十分困难的。Schulte Am Esch教授证实了猪vWF和人血小板GPIb受体的种间功能不兼容，因此，可以尝试选择性的调控猪vWF在个体化GPIb的结合位点。血小板vWF受体的唾液酸表达水平不同会导致脱唾液酸的水平也不同，这会增加血小板的清除，此过程在异种肝移植中会尤为明显。

4.6 人凝血酶原复合物（human prothrombin concentrate complex，hPCC）：针对猪到非人灵长类异种肝移植中血小板减少导致的致死性出血问题，美国麻省总院的肝移植团队，在2例GTKO-狒狒的肝移植过程中持续输注了外源性的hPCC，并测定了血循环中维生素K依赖凝血因子和非维生素K依赖凝血因子的活动度，提示移植肝脏有新生凝血因子生成，受体出血异常得到明显改善。最后，2例受体的存活时间分别延长至 25［41］和 29 天［1］。

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