改良非梗阻性无精子症患者睾丸精子快速冷冻解冻方法获临床妊娠1例

宋雪梅 严为巧 黄晓洁

作者单位：221009 江苏，徐州市妇幼保健院生殖医学中心

临床上，无精子症可以分为非梗性无精子症和梗阻性无精子症两类。无精子症患者通过外科手术取精并借助辅助生殖技术可以拥有自己的遗传学后代。2016年6月本院生殖医学中心对经皮睾丸多点细针抽吸精子进行快速冷冻解冻后行单精子卵胞浆注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)并获得临床妊娠，现报道如下。

临床资料

1.病史：患者，男，26岁，因婚后6年未避孕未孕来本院就诊。生殖系统检查，左侧睾丸约16 ml，右侧睾丸约17 ml，生殖激素测定示FSH:3.24 U/L，LH1.78 U/L，T:296 ng/dl，PRL:8.66 ng/ml，E2:25.6 pg/ml，分析染色体核型正常，超声生殖系统检查未发现明显梗阻。禁欲3 d以上分别采集3 次精液，常规检查离心后高倍镜下多张涂片、多个视野未见精子。于2015年9月11日利多卡因局部麻醉，行经皮睾丸多点细针抽吸精子，将穿刺取得的曲细精管浸于Quinn′s-1006 (SAGE，America)培养液加10%人血清白蛋白(HSA，SAGE，America)，在解剖镜下使用1 ml注射器针尖小心地剥开曲细精管，再于倒置显微镜下观察寻找精子。女方，28 岁，月经规律，子宫腺肌瘤，本中心常规超长方案促排卵。

2.精子冷冻：将经处理后含有割碎曲细精管的精子悬液离心(2 000 转/分钟)10 min，倒掉上清，用100微升5%HSA的Quinn′s1006培养液重悬沉淀，与精子冷冻保护剂(SAGE，America)1:1混匀，移入冷冻麦秆进行分装，麦秆在液氮上方距液氮面3 cm、2 cm、1 cm处各放置40秒，最后放入液氮中长期保存。

3.精子解冻：冷冻精子麦秆从液氮迅速插入ICSI皿37℃矿物油，待麦秆上的微滴颜色变浅后迅速转移至Quinn′s 1023操作滴[1]，倒置显微镜下找精子。

结果

2015年10月13日取卵，获卵9个，MⅡ卵5个，行ICSI，正常受精4个，D2天移植2个优质胚胎(4CⅠ和5CⅡ)，剩余2个三级胚胎继续培养至D6天，无囊胚形成。胚胎移植后11天外周血测β-hCG阳性。目前婴儿已活产，身体各项指标均正常。

讨论

非梗阻性无精子症患者，若附睾穿刺术未观察到精子不得不行睾丸活检，而重复的睾丸取精可能会对睾丸功能产生负面影响，为减少睾丸穿刺取精的次数，冷冻保存睾丸活检获得的精子以更好的保护男性生育力。研究报道，采用传统的精子冷冻方法和利用空透明带为载体保存睾丸精子，前者精子冷冻解冻后的回收利用率低，后者因伦理问题限制其在临床上应用[2-3]。众所周知，睾丸穿刺获得的精子往往数量少，活力差，提高睾丸精子冷冻解冻后的回收利用率是其能在临床上广泛应用的前提。2013年，刘吉等[4]报道睾丸组织冷冻结合胞浆内单精子注射临床妊娠1例，但精子解冻后偶见微动精子，说明解冻后的精子活力较差。2016年，史海跃等[5]研究睾丸精子冷冻复苏对ICSI助孕结局的影响，其中精子复苏过程需加入培养液对精子离心洗涤，这个过程中势必降低精子回收利用率。本文病例将冷冻精子麦秆从液氮直接放入ICSI皿37℃矿物油中解冻并迅速移入精子滴，精子不需要离心洗涤，可以全部回收，直接在精子滴中挑选活力好的精子行ICSI，患者成功妊娠并活产。整个冷冻解冻过程时间短，易于操作。此方法除可以用冷冻精子数量少、活力差的附睾、睾丸精子外，还可以用于严重少精子症患者的冷冻，避免女方取卵日因射出精液中无精子而行有创性的附睾、睾丸穿刺。总之，本文采用的快速冷冻解冻方法可以用于稀少精子快速冷冻解冻，适于在辅助生殖临床上推广应用。