微小RNA对肿瘤耐药性影响的研究进展

林榆凯 ，骆亚君 ，沈琪琼 ，江国琛 ，余汶佳 ，陈晓云 ，陈昱行 ，王佳新 ，师苗苗 ，黄凯鑫 ，邹珍友 ＊

（1.台州学院 医学院， 浙江 台州 318000；2.清华大学 材料科学与工程学院， 北京 100000；3.浙江大学 医学院， 浙江 杭州 310002）

1 引言

化疗是中晚期恶性肿瘤患者治疗的主要方法。但在化疗过程中，肿瘤细胞会对药物产生耐药性，使得患者的预后及生存率无法得到有效的保障。科学家和医务工作者都在积极寻求克服癌耐药性的方法。随着分子医学的快速发展，人们发现microRNA在肿瘤耐药性的调控中具有重要作用。这为临床治疗肿瘤提供了一条新的途径。本文通过总结近几年microRNA在肿瘤耐药性调控的实验发现，阐述其在抗瘤耐药性方面的分子机制，为人们利用其提高癌症化疗敏感性提供方法。

2 肿瘤的耐药性机制

肿瘤的耐药性是患者在一段时间内接受某一种抗肿瘤药物后出现治疗未响应的现象。根据治疗前后的来源可以分为治疗前即存在的天然耐药性（natural resistance）和随着治疗过程而产生的获得耐药性（acquired resistance）［1］。获得耐药性主要机制涉及到膜上的药物外排分子（例如P糖蛋白（P-gp），耐药相关蛋白）增加，使药物外流作用加强；细胞解毒能力的提高，例如谷胱甘肽S-转移酶-β（GST-π）、金属硫蛋白的活性和表达的改变；肿瘤细胞DNA修复能力的提高［2］。在临床上，一旦肿瘤耐药性的形成将大大降低肿瘤的化疗效果，同时化疗药物给患者带来巨大副作用，导致肿瘤患者治疗后期无药可用。

3 miRNA生物合成和功能

miRNA是一类广泛存在于生命体内，由22-24个核苷酸组成的高度保守的短链非编码RNA。研究发现miRNA对哺乳动物20%-30%的蛋白质基因表达起着调节作用［3］。在一些特定的疾病如癌症等可被激活，其对疾病的发生发展有着不可小觑的作用。miRNA的原始形式是由基因组DNA在RNA聚合酶Ⅱ作用下产生长度为300-1000个碱基的Pri-miRNA，再经酶Drosha和dsRNA结合蛋白DGCR8的切割形成70个核苷酸，具有茎环结构的前体RNA（pre-miRNA）［4］。最后由Dicer酶加工后生成具有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21-25 nt的小分子RNA片断。miRNA大部分在转录后通过复杂的信号转导网络靶向调控mRNA，成熟的miRNA与靶mRNA的3’-UTR区域结合抑制靶mRNA的翻译，再通过与miRNA上被称为‘种子区域’的5’末端的2-8个核苷酸结合干扰mRNA的翻译［5］。miRNA转录后水平的调控也是胚胎发育，细胞增殖，细胞生长，组织分化细胞凋亡的重要影响因素，影响着个体的生长发育、代谢、衰老和疾病的进程。

4 miRNA对肿瘤耐药性的调控机制

许多研究表明miRNA在肿瘤细胞中的药物的代谢，受体配体的合成，诱导DNA损伤应答及凋亡信号分子的传导，同时也可以通过抑制细胞周期蛋白来抑制肿瘤细胞的生长［6-8］。miRNA与肿瘤耐药性形成密切相关，研究miRNA在肿瘤耐药性中的调控机制对临床肿瘤的治疗具有重要意义。

4.1 膜上药物外排分子改变相关的miRNA与肿瘤的耐药性

细胞膜上药物外排分子的改变是肿瘤细胞产生耐药的重要途径。它能减少药物在肿瘤细胞中的积累。当细胞内药物下降至有效浓度以下，其将失去对肿瘤细胞的杀伤力从而引起肿瘤的耐药性。通过应用X射线衍射及电子显微镜对ATP结合盒超家族（ABC），主要辅助因子超家族（MFS）和抗性结瘤分子超家族（RND）三大超家族MDR转运蛋白的结构分析，发现ABC超家族在肿瘤耐药性方面具有重要作用［9］。ABC超家族中最重要的MDR相关成员是ABCB1（P-糖蛋白，MDR1），ABCC1（多药耐药相关蛋白1，MRP1））和ABCG2（BCRP）［10］。许多研究表明ABC转运蛋白超家族受miRNA的影响。Jin通过在人胃腺癌细胞（SGC7901）建立抗紫杉醇（TPX）细胞系并检测到在SGC7901/TPX细胞中miR-21及ABCB1转运蛋白含量显著升高，推测miR-21可通过调节P-gp来改变肿瘤耐药性［11］。相反一些miRNA的水平与胃癌的耐药性呈负相关。通过qRT-PCR定量测定，发现miR-129水平升高反而降低了癌组织的p-gp的含量，这表明miR-129的过表达可逆转胃癌细胞的耐药性［12］。Lin等在阿霉素（ADR）耐药的人乳腺癌（MCF-7）细胞（MCF-7/ADR）中发现miR-302（包括miR-302a/b/c/d）通过靶向ERK通路的MEKK1抑制P-gp使乳腺癌细胞对化疗药物敏感［13］。然而这种方式并非通过典型的miRNA介导的mRNA降解，而是在蛋白质和转录水平上。此外，实验者通过对miR-302a/b/c/d的组合表达比相同剂量的单个miRNA更能有效的诱导人乳腺癌细胞的多药耐药性，这表明miRNA在诱导耐药蛋白的形成与激活时具有协作性，同时强调了在miRNA在治疗肿瘤耐药性中靶向的重要性。miRNA不仅在实体肿瘤中改变膜上外排蛋白在白血病患者中也具有重要影响。Soltani等在伊马替尼（IM）耐药慢性粒细胞白血病（CML）中通过构建网络调控路径揭示了hsa-miR-451a直接参与激活ABCB1，并且也与MYC基因一起调节hsamiR-29a，使信号流向RAN。RAN和ABCB1这两种外排分子的激活都是造成IM累积减少的原因，因而产生了耐药性［14］。

4.2 miRNA的水平影响细胞凋亡与肿瘤耐药性

细胞凋亡途径能通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤的增殖。而在某些药物的作用下当细胞凋亡途径被异常调控时可以使肿瘤产生耐药性。细胞凋亡途径可以分为外源性和内源性两种。外源性凋亡途径主要通过与fas受体（CD95/apoptosis-1R）和肿瘤坏死因子受体（TNFR）结合的三聚Fas配体（FasL）和肿瘤坏死因子（TNF）。内源性凋亡途径则是通过抗抑制细胞凋亡Bcl-2超家族激活Bax。miRNA水平的改变可以通过靶向细胞凋亡抑制剂（IAPs）相关凋亡蛋白的激活来影响肿瘤细胞对化疗药物产生的敏感性［15］。Lin等人发现在人骨肉瘤中miR-202的含量比正常人成骨细胞中要高，其由TGF-β1诱导并通过靶向凋亡相关蛋白PDCD4增强了骨肉瘤细胞对化疗药物多柔比星的抗性。进一步实验研究发现在TGF-β1信号通路中，smad2，smad3和smad4等是关键的调控因子，其有助于细胞的凋亡与增殖［16］。Xia等人发现在胃癌细胞中miR-362显著上调，抑制miR-362可导致胃癌细胞G1/S停滞促进细胞凋亡。核因子κB（NF-κB）信号通路在其中扮演了重要角色。它通过miR-362直接标靶CYLD去泛素化酶使其下调介导NF-κB的活化进而改变相关凋亡基因使胃癌对顺铂产生耐药性［17］。同样在胃癌中，Wang等通过miRNA微阵列分析发现多耐药细胞系人胃腺癌细胞SGC7901/DDP中miR-17-5p比起亲本SCG7901细胞显著上调。同时在实验组加入miR-17-5p抑制剂后，SGC7901/DDP对阿霉素（ADR）、长春新碱（VCR）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）等抗肿瘤药物的IC50（半数抑制最大浓度）均有一定程度的下降［18］。这表明敲低miR-17-5p能逆转人胃腺癌细胞的耐药性。通过Pic Tar和Miranda算法预测凋亡相关基因P21可能是miR-17-5p的潜在标靶。实验证实当miR-17-5p下降时，细胞的凋亡率显著增加，且细胞中G1/S阻滞的细胞百分比的增加，因此miR-17-5p通过靶向P21改变细胞的凋亡率来参与胃癌细胞的化学敏感性。在一项新的实验成果中，Zeng等人利用载有miR-122的石墨烯-InP纳米复合物靶向诱导耐药肝癌细胞凋亡［19］。此项实验基于肝癌细胞中miR-122的异常表达并具有靶向性引起凋亡的蛋白的激活对抗肝癌细胞的耐药性。通过研究经负载了miR-122-InP@ZnS量子点纳米复合材料的石墨烯-P-gp（GPMQNs）在HepG2/ADM细胞中细胞凋亡的机制发现miR-122是通过抗凋亡蛋白活化的抑制，并通过caspase9和8的激活以及Bcl-2途径引起细胞凋亡。Xu等对8名胰腺癌患者分析证明胰腺癌组织中miR-374b-5p的表达显著低于相邻正常组织。并通过吉西他滨处理胰腺癌细胞得出miR-374b-5p的低表达能显著增加胰腺癌细胞对吉西他滨（GEM）的抗性。沉默miR-374b-5p可增加GEM敏感的胰腺癌细胞系中的几种抗凋亡蛋白BCL2、BIRC3、XIAP的表达［20］。BIRC3和XIAP是属于IAP蛋白家族通过直接结合并抑制半胱天冬酶的内源性凋亡的抑制因子，而BCL2属于Bcl-2家族的凋亡抑制剂，miR-374b-5p通过以上3种凋亡蛋白的调控是引起胰腺癌细胞耐药性的重要原因。

4.3 miRNA通过改变肿瘤细胞DNA修复能力与耐药性

改变启动子DNA修复基因（AGF，FANCF，MLH1，SRBC）的甲基化模式可以使肿瘤细胞获得耐药性［21］。尽管在抗肿瘤药物使用过程中，化疗药物可以引起肿瘤细胞DNA的损伤。但因为存在众多修复途径可以有效的处理损伤的DNA引起肿瘤的耐药性［22］。通过这种方式产生的耐药性广泛存在于各种肿瘤细胞中。Zhao等人在对非小细胞肺癌 （NSCLC）研究中观察到在耐顺铂的A549/DDP细胞中miR-17和miR-92家族表达下调。由于磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）是顺铂诱导的DNA双链断裂（DSBs）的早期参与者，通过检测传染miR-17模拟物，miR-92a模拟物或si-RAD21的A549/DDP细胞中顺铂诱导的γH2AX灶明显高于A549细胞。由此推断miR-17和miR-92的下调并且通过靶向Rad21同系物 （S.pombe）（Rad21）来实现非小细胞肺癌的耐药性［23］。另外miRNA的一个重要的家族——let-7家族的研究进展同样也是令人兴奋的。let-7于2000年首次被鉴定，其有13个家族成员，许多研究表明let-7的大多数成员已经参与调节肿瘤药物敏感性［24］。Man等在上皮性卵巢癌（EOC）中比较了22例化疗耐药EOC和43例化疗敏感EOC中let-7e的表达。结果显示在化疗耐药EOC中let-7e表达显着降低。为了研究let-7e与肿瘤细胞DNA修复的关系，通过比较DNA双链断裂修复（DNA DSB）的修复动力学的差别，发现在OV2008细胞中let-7e的下调使DSB修复加速［25］。此外Werstern印迹分析显示，在A2780，OV2008和C13K细胞中let-7e过表达显著降低BRCA1和Rad51的表达。鉴于Rad51蛋白和BRCA1发挥HR介导DSB修复的重要作用由此推测let-7e通过部分下调Rad51蛋白和BRCA1来对顺铂产生耐药性。同样在卵巢癌细胞中（VOC），Zhao等对来自53个患者的样本信息进行队列研究证实卵巢癌细胞中的miR-770-5p含量对化疗预后具有重要参考价值，这可能是与miR-770-5p与卵巢癌细胞对顺铂的敏感性有关［26］。据报道核苷酸切除修复（NER）参与了肿瘤化疗耐药性的过程。miR-770-5p通过靶向NER中候选靶基因之一的ERCC2，它参与了DNA的复制重组和修复过程。在卵巢癌顺铂治疗的不完全响应组中，miR-770-5p含量下调，ERCC2大量表达通过识别并修复被顺铂结合并解链的加合物，引起肿瘤的快速生长对顺铂产生抗性。

5 未来与展望

miRNA作为在疾病发生发展过程中的一个重要的调控因子，在肿瘤的耐药和预后中发挥重要作用。近年来许多实验研究证明miRNA可以通过各种机制对抗肿瘤药物敏感性及耐受性。然而目前人们对miRNA认识仍然有限，许多肿瘤耐药基因及信号通路还未被发现，但诸多研究表明其可作为治疗剂和药物标靶的作用，这将为肿瘤的治疗提供新的思路和途径［27］。miRNA的网络调控途径极其复杂，能否发现新的广谱治疗靶点也将是研究者努力的方向。在临床诊疗中，通过分析患者肿瘤细胞内miRNA谱，寻找关键的miRNA，并进行靶向治疗，个性化给药方式逆转肿瘤细胞对药物的抗性，改善治疗效果。同时可以检测miRNA水平来筛查一些早期肿瘤的病例及对患者预后的分析评估提供重要依据。通过对miRNA对肿瘤细胞耐药性的调控机制进行深入研究，将有助于人类更好的攻克治疗肿瘤的难题。