产N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌构建、发酵及应用研究进展

秦志杰，岳秋林*，刘新利

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东 济南 250353）

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyleneglucosamine，GlcNAc）是一种氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的衍生物，是生物体内多种多糖的基本组成单位，也是合成双歧因子的重要前体，易溶于水，具有还原性，在生物体内具有重要的生理功能。GlcNAc广泛存在于自然界中，于动物体、植物体、细菌和真菌中均有存在，是几丁质和壳聚糖的主要成分[1-3]。GlcNAc主要应用于食品保健、医药、化妆品等领域，需求量大，市场广阔。作为膳食补充剂，GlcNAc具有保护软骨组织及骨关节作用；作为药品，GlcNAc在治疗炎症性肠病方面表现出明显功效。同样因其能够提高内质网蛋白内稳态的作用，可起到延长细胞寿命的作用[4]。在欧美等发达国家，GlcNAc己经作为膳食补充剂而被广泛应用[5]。GlcNAc的传统生产方法主要采取甲壳素水解法，该方法在原料供应、环境保护及产品安全方面存在许多潜在问题[3，6]，首先，以虾、蟹壳中的甲壳素作为原料，随着GlcNAc市场需求的日益增加，原料供给可能出现短缺，导致GlcNAc市场供应不足；其次，如今甲壳素水解法采用酸水解，GlcNAc生产过程中产生大量废水，严重污染环境；最后，来源于虾、蟹壳的GlcNAc可能使对海产品过敏的人群产生过敏反应[7]。因此，食品安全级的、非甲壳类动物来源的GlcNAc是目前消费者需求的产品。微生物发酵法不受原料来源的季节和地域限制，生产效率高，污染小，而且不会产生过敏反应。因此，微生物发酵法具有可持续性的重大社会经济效益，构建高效生产GlcNAc的基因工程菌，采用微生物发酵法生产GlcNAc可有效解决其传统生产方法所带来的诸多问题[8]。现如今国内外研究较深入的生产GlcNAc的基因工程菌主要为大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。在这些工程菌的构建中，基础的思路都是过表达GlcNAc合成途径的关键酶基因，敲除降解途径的关键酶基因以及主要副产物的合成酶基因。近些年，随着代谢工程的不断发展，支架介导途径、模块化工程、动态调控、代谢组学分析等方法逐渐应用于工程菌的构建中以提高GlcNAc的产量，高效生产GlcNAc的基因工程菌的构建及发酵在工业化生产中表现出了巨大的潜力和吸引力。

随着GlcNAc市场需求的日益增加，存在诸多潜在问题的传统生产方法所生产的GlcNAc在产量及品质上渐渐不能满足人们的需求，构建高产GlcNAc的工程菌给人们指出了新方向，并显示出了巨大潜力。本文主要从产GlcNAc的工程菌的构建与GlcNAc应用现状方面进行了整理综述，并展望了其重点的研究方向，以期为GlcNAc的发酵生产及广泛应用提供支持。

1 GlcNAc工程菌的构建及发酵

1.1 大肠杆菌产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建及发酵

大肠杆菌因易于培养、生长周期短、遗传背景清晰、遗传操作技术简便成熟等优点被广泛应用于代谢工程的改造，并被用于发酵生产许多有经济价值的化合物[9]。

2005年DENG M D等[10]使用一系列代谢工程策略构建了一株产GlcN和GlcNAc的高性能的重组大肠杆菌菌株。首先，使用易错聚合酶链式反应（error-pronepolymerasechain reaction，epPCR）进行氨基葡萄糖合成酶（glucosamine synthase，GlmS）的定向进化，并获得了解除产物抑制的GlmS，并证明过表达突变体GlmS可有效增加GlcN产量，使GlcN质量浓度达到了75 mg/L水平。然后，T7lac-ScGNA1的表达盒被整合在manXYZ基因座上，整个nagBACD操纵子和乙酰氨糖转运基因nagE的一部分被替换为四环素抗性基因tetR，使GlcN产量达到了17 g/L。最后，为了避免GlcN的快速降解并缓和GlcN及其降解产物对宿主细胞的抑制作用，过表达了异源的GlcN-6-磷酸（phosphate，P）乙酰转移酶基因（GNA1）以延伸途径至GlcNAc，因为GlcNAc是一种在大肠杆菌宿主内稳定和惰性的氨基糖。最终以葡萄糖为合成GlcNAc的底物，在1 L罐的流加方式下，经过诱导和条件优化后，于发酵72 h时，构建好的菌株GlcNAc产量达到了110 g/L。DENG M D等的工作解除了GlcN-6-P对氨基葡萄糖合成酶的抑制以及氨基葡萄糖和它的降解产物对宿主细胞的抑制效应，并且进一步阻断了GlcN和GlcNAc向胞内的转运进而阻止其作为碳、氮源的胞内降解利用，为后续生产GlcNAc基因工程菌的构建提供了基础思路和方向指导。

除了在在宿主菌中对其合成途径和转运途径进行基因工程改造外，宿主菌的培养条件对提高乙酰氨基葡萄糖产量也十分重要。2012年，陈欣等[11]通过过表达氨基葡萄糖（GlcN）合成酶基因和GlcN-6-P乙酰转移酶基因构建了有效生产GlcN和GlcNAc的重组大肠杆菌。并运用Red同源重组技术敲除其转运子编码基因nagE与manX，培养双基因敲除菌株至10 h时，GlcN产量达到了最大值4.82 g/L，同时GlcNAc产量达到了最大值118.78 g/L，分别是对照菌株的1.2倍和2.86倍。该结果表明，转运子编码基因nagE与manX的敲除可显著降低胞外的GlcN与GlcNAc向胞内转运，从而提高GlcN与GlcNAc在发酵液中的积累量。并对恒速补料、间歇补料和指数补料这3种不同的葡萄糖补料策略对GlcN和GlcNAc产量的影响进行了研究，以进一步增强GlcN和GlcNAc生产。该研究构建了有效生产GlcN和GlcNAc的重组大肠杆菌，通过使用重组菌E.coli-glmS-GNA1研究了葡萄糖补料策略（恒速补料、间歇补料和指数补料）及溶氧水平对GlcN和GlcNAc生产的影响，并开发了多级葡萄糖供应策略。而且其开发的时间依赖的葡萄糖补料方法可能对重组大肠杆菌生产其他精细化学品同样适用。

1.2 枯草芽孢杆菌产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建及发酵

大肠杆菌工程菌相对于传统甲壳素水解法表现出了巨大优势及应用潜力，然而，E.coli作为工业化生产宿主存在以下不足：首先，因为E.coli不是食品安全级菌株，使得E.coli来源的GlcNAc应用领域有限。其次，E.coli易在发酵过程中受噬菌体污染，在工业规模发酵生产中不适用。因此，适合于工业规模发酵生产的食品安全级菌株是微生物发酵法生产GlcNAc的理想菌株。许多通常被认为安全的微生物菌株（generally regarded as safe，GRAS）已被鉴定，并被开发用于营养保健品的合成，而且已经利用这些菌株实现了许多重要营养制品的生产[12]。枯草芽孢杆菌发酵工艺成熟、遗传背景清晰、基因操作技术成熟并且不易受噬菌体污染，被广泛应用于发酵工业以生产透明质酸（hyaluronic acid，HA）、核黄素等各种化合物，B.subtilis是一种重要的食品安全级工业生产菌株[13-15]。因此，B.subtilis是生产GlcNAc的理想宿主。

刘延峰等[16]构建了重组枯草芽孢杆菌菌株以提高GlcNAc生产。使用基因工程，将基因GlmS和Gna1共同过表达以增强GlcNAc的合成，同时敲除基因nagP、nagA、gamA和nagB以阻止GlcNAc的降解。在3 L补料分批生物反应器中获得了5.19g/L的GlcNAc产量[17]。然后通过基于脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）引导的支架系统的空间调控控制关键酶Gan1和GlmS的比例为2∶1，增强了关键途径中氨基葡萄糖合成酶与GlcN-6-P乙酰转移酶的酶活。通过基因spo0A和sigE的敲除阻断了孢子形成。此外，通过呼吸链工程敲除了编码细胞色素的基因以减少维持新陈代谢的需求。这些方法将GlcNAc的产量提高到了20.58g/L[18]。为了进一步提高GlcNAc产量，将GlcNAc合成相关的代谢网络中的糖酵解途径、肽聚糖合成途径以及N-乙酰氨基葡萄糖合成途径三个模块，通过模块化工程进行了优化组装。最终改造后的枯草芽孢杆菌在3 L发酵罐进行补料分批发酵，葡萄糖初始含量为20 g/L。通过这种补料分批发酵方式，GlcNAc产量达到了31.65 g/L[19]。

朱妍荻[20]以一株可合成GlcNAc的重组枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过单敲除prophage1、prophage3、skin、PBSX和pks五个区域的非必需基因组片段，进一步提高细胞代谢效率和GlcNAc合成效率，并在此基础上，对重组枯草芽孢杆菌合成GlcNAc的发酵条件进行了优化，将葡萄糖含量控制在5g/L进行溶氧分阶段调控（0～7h，30%；7～15h，50%；15～50 h，40%；50～72 h，30%）。在此条件下，GlcNAc产量提高到了35.77g/L，显著提高了GlcNAc的产量和生产强度。

1.3 其他生产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建及发酵

在其他食品安全菌株中，很多研究者同样做出了构建生产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的尝试并取得了一定进展。

王雅婷等[5]尝试构建了一株新的基因工程菌谷氨酸棒状杆菌来生产GlcNAc。通过增强GlcNAc的合成途径，并敲掉GlcNAc的消耗代谢途径及主要副产物合成途径，使得构建的工程菌glmS-gnal-C.g-△nagAB在250 mL摇瓶发酵体系中GlcNAc产量达到1.43 g/L左右；随后将合成副产物乳酸的乳酸脱氨酶基因ldh敲掉，使得glmS-gnal-C.g-△nagAB△ldh生产GlcNAc能力达到2.23 g/L，副产物乳酸浓度几乎为0；实验结果证明了构建谷氨酸棒状杆菌工程菌生产GlcNAc的可行性。

LEE S W等[21]通过过表达无变构调节的Gfa1p突变体和像卤代酸脱卤素酶的磷酸酶YqaB证明了GlcNAc在酿酒酵母中的生产，并进一步降低糖酵解通量提高了GlcNAc产量。并发现真核磷酸果糖激酶1被果糖2,6-二磷酸变构激活。合成F26BP的PFK-2的破坏，导致GlcNAc产量的轻度降低并且葡萄糖消耗量和乙醇产量没有显著变化。但是，当使用半乳糖作为无PFK-2菌株的唯一碳源时，GlcNAc产量明显增加并且乙醇产量减少，这表明可以使糖酵解通量进一步降低以提高GlcNAc产量。

2 GlcNAc应用现状

GlcNAc属于氨基糖的一个大类，具有许多功能，如除了用作营养补充剂外，GlcN还被用于食品和运动饮料以生产用于关节健康的功能性食品，并用于化妆品中改善皮肤水分[22]。GlcNAc及其类似物（如几丁质和壳聚糖），可作为生物的碳或氮源。实际上，它们也可以用作生物质，已有研究显示粘红酵母（Rhodotorula glutinis）能够将GlcNAc转化为生物燃料。GlcNAc也是糖蛋白，蛋白多糖，粘多糖和其他结缔组织构件的组分，而粘多糖和糖蛋白是组织修复和抗炎反应的底物材料，于是人们发现GlcNAc也是治疗多种疾病的十分有价值的药剂[23]。

2.1 GlcNAc在食品领域的应用

GlcNAc溶解后可明显抑制一些细菌和真菌的生长且具有一定成膜性，将其涂于果蔬表面形成薄膜，可以抑制果蔬失水速率及其呼吸强度，减缓营养物质的消耗，同时具有抑制微生物的侵染，减缓果蔬的腐烂，增加保藏时间的功能，从而达到保鲜目的[24]。因此GlcNAc可作为一种天然的抗菌剂和保鲜剂在食品保藏中发挥作用。GlcNAc还可与肉类食品在加热处理时从肉的血红蛋白中释放的铁离子形成螯合物，从而抑制铁离子的催化活性，起到抗氧化的作用，进而解决肉类食品中因含有高度易被氧化的不饱和脂肪酸，而使肉类食品容易腐败变质的问题。果汁中含有大量带负电荷的纤维素、果胶、多聚戊糖等物质，在存放期间很容易使果汁变浑浊。当上述负电荷物质和具有正电荷的GlcNAc吸附絮凝后，再经处理后的澄清果汁是一个稳定的热力学体系，所以能长期存放，不产生浑浊，因而GlcNAc亦可用作果汁、酒类等的澄清剂[25]。因为GlcNAc热量低、保健机能好，且被食用后血糖不会升高，可以作为糖尿病人和肥胖者的理想甜味剂；GlcNAc能够促进乳酸菌及双岐杆菌的生长，因此可将其添加到乳制品中，促进菌体生长繁殖；GlcNAc制成保健品可以减少人体肠道内有害菌群，增加有益菌群，调节菌群的分布，从而调整肠道内的微生态环境[26]。

2.2 GlcNAc在医疗方面的应用

关节软骨的基质为蛋白聚糖、软骨细胞和胶原蛋白，它可缓冲来自机械力的冲击，并提供一个光滑的骨表面，使骨头之间可以很容易滑过而不摩擦损伤。缺乏蛋白多糖前体和滑液会导致骨骼关节的结构和功能缺陷并发生骨关节炎。发病率随着年龄增长而增加，多发于65岁以上人群[23]。GlcNAc是软骨组织及关节液等的关键组成物质，GlcNAc能够再生并修复软骨组织，且能防止软骨组织遭受损伤，具有重要的药用效果。临床实验结果表明，GlcNAc不仅具有改善骨关节炎的作用，同时还有控制病情的作用[27]。GlcNAc也可以诱导白血病细胞的分化，很可能成为新的低毒、高效治疗白血病的候选药物[28]。另有研究表明，在白酒中加入GlcNAc后，肝组织及肠黏膜组织的损伤均有不同程度缓解，推测GlcNAc减轻乙醇对肝脏的损伤可能与GlcNAc恢复肠黏膜上皮细胞功能、稳定肠道黏膜屏障功能、抑制肠内细菌穿透肠上皮进入血液循环及内毒素入血有关。因此，GlcNAc可以缓解酒精对肝脏与肠道的损伤与破坏，对机体起到保护作用[29]。有学者发现，GlcNAc可以激活钙信号通路，诱导T细胞增殖，从而使T细胞在细胞免疫的过程中活化并特异性的攻击带有相应抗原的肿瘤细胞，从而实现抗肿瘤的目的[5]。GlcNAc的抗菌、调节机体免疫、抑制肿瘤细胞生长等特性，使其在医疗领域表现出巨大的市场潜力[30]。

2.3 GlcNAc在化妆品方面的应用

人体皮肤含有角质层和真皮层，用以保护身体免受干燥和紫外线照射等恶劣的环境条件损伤。角质层在维持皮肤的水分和紧致方面起着关键作用。它由扁平化的死细胞、角质细胞以及脂质基质和天然水分因子的复合物组成。真皮是皮肤的内层，由成纤维细胞产生的胶原蛋白、弹性蛋白和粘多糖组成[23]。胶原蛋白是健康肌肤保持弹性，强度，光滑度和丰满外观的原因。粘多糖（如透明质酸和蛋白聚糖）具有高保水能力，并且是保持皮肤水分的重要组分。透明质酸主要由成纤维细胞和角质形成细胞产生，是一种众所周知的能将角质层和真皮水分保留的成分[23]。GlcNAc可以促进人体内蛋白聚糖的代谢合成，并提高在人体肌肤中透明质酸的含量，透明质酸吸收水分后，使得弹力纤维及胶原蛋白处在充分湿润的环境中，从而维持细胞外基质的弹性，因此GlcNAc具有延缓肌肤衰老的功效，被添加在许多化妆品中以起到加强保湿的功效[20]。另外，BISSETT D L等[31]研究发现，口服天然GlcNAc能加强透明质酸在体内的合成，改善皮肤水润程度。国内有学者发现，GlcNAc能够抑制细胞内黑色素的形成，具有开发美白化妆品的潜力[32]。

3 结论与展望

目前构建的大肠杆菌工程菌虽然得到了较高产量的GlcNAc，但因大肠杆菌并非食品安全菌株，使其工业化生产受到限制。枯草芽孢杆菌作为遗传背景清晰、发酵工艺成熟、基因操作技术成熟并且不易受噬菌体污染的常用工业菌株，是生产GlcNAc的更好选择，但其目前产量不高，谷氨酸棒状杆菌工程菌及酿酒酵母工程菌面临着同样的问题。利用动态调控元件、代谢组学、动力学分析等手段进一步确定GlcNAc合成途径中的限速步骤并解除无效循环以提升枯草芽孢杆菌生产GlcNAc的能力仍然需要大量的研究。同时，溶氧水平等发酵条件的优化同样对提高GlcNAc产量具有重要意义。

[1]ASHRY E S H,ALY M R E.Synthesis and biological relevance of N-acetylglucosamine-containing oligosaccharides[J].Pure Appl Chem,2007,79(12):2229-2242.

[2]YADAV V,PANILAITIS B,SHI H,et al.N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase(nagA)is required for,N-acetyl glucosamine assimilation in gluconacetobacter xylinus[J].Plos One,2011,6(6):e18099.

[3]CHEN J K,SHEN C R,YEH C H,et al.N-Acetyl glucosamine obtained from chitin by chitin degrading factors inChitinbacter tainanesis[J].Int J Mol Sci,2011,12(2):1187-1195.

[4]WEIMER S,PRIEBS J,KUHLOW D,et al.D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice[J].Nat Commun,2014,5(4):3563.

[5]王雅婷.生物法合成N-乙酰氨基葡萄糖[D].北京：北京化工大学，2016.

[6]HULIKOVA K,SVOBODA J,BENSON V,et al.N-acetyl-D-glucosaminecoated polyamidoamine dendrimer promotes tumor-specific B cell responses via natural killer cell activation[J].Int Immuno Pharm,2011,11(8):955-961.

[7]DENG M D,SEVERSON D K,GRUND A D,et al.Metabolic engineering ofEscherichia colifor industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine[J].Metab Eng,2005,7(3):201-214.

[8]王 升，李丕武，刘佃磊，等.利用发酵法生产氨基葡萄糖的研究进展[J].生物技术通报，2014（1）：68-74.

[9]王俊明.利用重组大肠杆菌和核糖开关进行L-赖氨酸生产的研究[D].济南：山东大学，2015.

[10]DENG M D,ANGERER D J,CYRON D,et al.Process and materials for production of glucosamine and N-acetylglucosamine:US8124381[P].2012-2-28.

[11]陈 欣.代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖及过程优化与控制[D].无锡：江南大学，2012.

[12]LIU L,GUAN N,LI J,et al.Development of GRAS strains for nutraceutical production using systems and synthetic biology approaches:advances and prospects[J].Crit Rev Biotechnol,2015,37(2):1-12.

[13]DIJL J M V,HECKER M.Bacillus subtilis:from soil bacterium to super-secreting cell factory[J].Microb Cell Fact,2013,12(1):3.

[14]LIU L,LIU Y,SHIN H D,et al.DevelopingBacillusspp.as a cell factory for production of microbial enzymes and industrially important biochemicals in the context of systems and synthetic biology[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(14):6113-6127.

[15]MEYER F M,GERWIG J,HAMMER E,et al.Physical interactions between tricarboxylic acid cycle enzymes inBacillus subtilis:evidence for a metabolon[J].Metab Eng,2011,13(1):18-27.

[16]刘延峰.代谢工程改造枯草芽孢杆菌高效合成N-乙酰氨基葡萄糖[D].无锡：江南大学，2015.

[17]LIU Y,LIU L,SHIN H D,et al.Pathway engineering ofBacillus subtilis for microbial production of N-acetylglucosamine[J].Metab Eng,2013,19(5):107-115.

[18]LIU Y,ZHU Y,MA W,et al.Spatial modulation of key pathway enzymes by DNA-guided scaffold system and respiration chain engineering for improved N-acetylglucosamine production byBacillus subtilis[J].Metab Eng,2014,24(1):61-69.

[19]LIU Y,ZHU Y,LI J,et al.Modular pathway engineering ofBacillus subtilisfor improved N-acetylglucosamine production[J].Metab Eng,2014,23(5):42-52.

[20]朱妍荻.枯草芽孢杆菌代谢调控及过程优化生产N-乙酰氨基葡萄糖[D].无锡：江南大学，2015.

[21]LEE S W,OH M K.Improved production of N-acetylglucosamine in Saccharomyces cerevisiaeby reducing glycolytic flux[J].Biotechnol Bioeng,2016,113(11):2524-2528.

[22]LIU L,LIU Y,SHIN H D,et al.Microbial production of glucosamine and N-acetylglucosamine:advances and perspectives[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(14):6149-6158.

[23]CHEN J K,SHEN C R,LIU C L.N-acetylglucosamine:Production and applications[J].Marine drugs,2010,8(9):2493-2516.

[24]池亚斌.枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖条件优化控制研究[D].无锡：江南大学，2016.

[25]姬小明，王建玲.甲壳素和壳聚糖及其衍生物在食品工业中应用新进展[J].平原大学学报，2003，20（4）：6-7.

[26]徐小芳.乙酰氨基葡萄糖合成关键酶GlmS和Gna1的筛选及催化动力学分析[D].无锡：江南大学，2016.

[27]沈若武，龚少兰，王守彪，等.N-乙酰氨基葡萄糖对骨折愈合的实验性研究[J].中国临床解剖学杂志 ，2004，22（4）：394-397.

[28]王 哲，乔 岩.N-乙酰氨基葡萄糖诱导白血病细胞K562向巨噬细胞分化[J].第四军医大学学报，2003，24（1）：46-48.

[29]赵 莹，吴小兰，郭林明，等.N-乙酰氨基葡萄糖对乙醇致肝组织损伤的保护作用及其机制[J].吉林大学学报：医学版，2011，37（3）：456-459.

[30]龚福明，何彩梅，唐小艳，等.微生物几丁质酶的研究进展及应用现状[J].中国酿造，2017，36（8）：20-25.

[31]BISSETT D L.Glucosamine:an ingredient with skin and other benefits[J].J Cosmet Dermatol,2010,5(4):309-315.

[32]金宛宛，张荣鑫，林 茂，等.N-乙酰氨基葡萄糖对小鼠B16黑素瘤细胞凋亡的影响[J].中国生物美容，2009（4）：5-9.