小麦黄色素含量与多酚氧化酶活性相关基因的分子标记检测及分布差异

陈泠+高春保+朱展望+佟汉文+刘易科+张宇庆+邹娟+鲍文杰

摘要：用黄色素含量和多酚氧化酶活性相关分子标记对277份国内小麦（Triticum aestivum L.）品种（系）进行了检测，发现1B/1R易位系出现频率为27.1%，控制低多酚氧化酶（PPO）活性等位基因Ppo-A1b和Ppo-B1a分布频率为53.1%和65.3%，控制低黄色素（YP）含量的等位基因Psy-A1b和Psy-B1b出现频率分别是39.7%和55.6%。后4种基因型在各省份间分布频率差异很大，等位基因Ppo-A1b在河南品种中频率较低，为28.6%；Ppo-D1a基因型在陕西地区最低，为14.3%；Psy-A1b等位基因在河南和山东品种中分布频率很低，仅为15.7%和13.3%；Psy-B1b在江苏和山东地区较低，分别为25.0%和36.7%；四川品种中这4种等位基因出现频率都较高。根据不同地区面粉色泽相关等位基因分布差异，制定适宜育种策略，能更有效地改善该地区小麦新品种的面粉色泽。

关键词：小麦（Triticum aestivum L.）；黄色素含量；多酚氧化酶活性；1B/1R异位；分子标记

中图分类号：S512.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4892-07

随着生活水平的提高，人们对面制品外观色泽的要求也越来越高。亮白到乳白的面制品，如馒头、饺子、盐白面条等更受到消费者的喜爱。黄色素（YP）含量和多酚氧化酶（PPO）活性都影响面制品的色泽，前者含量高使面制品呈现黄色，后者活性高导致面制品褐化，色泽变暗[1，2]。选育低YP含量和低PPO活性的小麦（Triticum aestivum L.）品种可有效增强面粉及面制品白亮色泽[3，4]，更受市场欢迎。

应用分子标记可快速筛选目标基因，提高品种选育效率。研究表明，八氢番茄红素合成酶（PSY）是面粉中黄色素物质——类胡萝卜素合成的一个关键酶，对面粉中的YP含量起着重要作用[5]。He等[6，7]开发了PSY基因的多个分子标记，其中YP7A标记可区分小麦7A染色体上Psy-A1a和Psy-A1b等位变异，分别控制高、低YP含量；YP7B-1和YP7B-2标记可区分小麦7B染色体上的Psy-B1a、Psy-B1b和Psy-B1c等位基因，分别对应中高、低和高YP含量。He等[6，7]还发现1B/1R易位的存在对YP含量起正相关作用，因此，通过筛选基因组中含等位基因组合Psy-A1b/Psy-B1b/non 1B/1R的材料，进而可选出YP含量低的品种。PPO活性控制基因主要位于第2染色体组，Sun等[8]开发了2AL染色体上PPO活性基因的分子标记PPO18，可区分PPO-A1a和PPO-A1b等位变异，分别控制高、低PPO活性。He等[9]开发了2DL染色体上的分子标记PPO16和PPO29，可分别检测低PPO活性等位变异PPO-1Da和高PPO活性等位基因Ppo-D1b。PPO活性基因等位变异组合中，含Ppo-A1b/Ppo-D1a組合的小麦品种，其PPO活性相对最低。

本研究利用与面粉及面制品色泽相关分子标记YP7A、YP7B-1、YP7B-2、PPO18、PPO16、PPO29以及IB/1R易位系分子标记[10]对277份小麦品种（系）进行了检测，分析了国内小麦主产省间相关等位基因变异特点，以期为高白度色泽小麦品种的选育提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

277份小麦品种（系）由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供，分别来自河南、江苏、湖北、山东、陕西、四川、北京、河北、山西、甘肃、宁夏和安徽等省（市），为近20多年来育成的品种（系），基本反映了各省市的品种特点。因后6省市各自的样品数较少 （≤12），本研究中仅列出有关数据提供参考，不进行比较分析。

1.2 叶片DNA的提取

材料种于湖北省农业科学院粮食作物研究所试验田，2016年12月初取材，用CTAB法进行叶片DNA的提取，详细步骤见参考文献[11]。每个品种（系）取不同3株小麦的叶片，结果一致的为准确数据，3次结果不同的继续取3株材料，以重复次数最多者为最终检测结果。

1.3 分子标记检测

试验所用分子标记的相关信息见参考文献[11]。PCR反应体系为10 μL，含2×Es Taq Mater Mix （Dye） 5 μL（康为世纪生物科技有限公司）、20 μmol/L上下游引物各0.1 μL、10～50 ng DNA模板1 μL。PCR产物用含EB的1%琼脂糖凝胶电泳后成像分析，YP7B-1标记PCR产物1 μL经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染分析。

2 结果与分析

2.1 1B/1R异位系的分子标记检测

供试小麦材料分子标记检测结果见表1所示。对277份材料的1B/1R易位系分析结果（表2）表明，27.1%的材料为1B/1R易位系。其中河南和陕西材料中1B/1R易位系频率较高，分别为34.3%和38.1%；江苏、湖北和山东品种中1B/1R易位系出现频率较低，分别为15.4%、15.2%和16.7%；四川省与总体频率相当。

2.2 PPO活性基因的分子标记检测

PPO18分子标记可检测Ppo-2A位点的2种基因型，即Ppo-A1a和Ppo-A1b；Ppo-2D位点有Ppo-D1a和Ppo-D1b基因型，分别由PPO16和PPO29分子标记检测。这两个位点控制低PPO活性的基因型是Ppo-A1b和Ppo-D1a，出现频率分别为53.1%和62.3%，后者比前者高近10%，均略高于相对应控制高PPO活性的基因型频率。低PPO活性Ppo-A1b和Ppo-D1a两种等位基因在各省份品种中频率差异较大，河南品种Ppo-A1b频率很低，仅为28.6%，其他5省品种差异较小，频率范围为60.6%～65.0%。等位基因Ppo-D1a在陕西品种中频率最低，只有14.3%，四川品种中频率最高，为85.0%，山东中频率为50%，河南、江苏和湖北地区该等位基因频率差异较小。endprint

2.3 YP含量相关基因分子标记检测

YP7A标记可检测7A位点2种基因型Psy-A1a和Psy-A1b，YP7B-1和YP7B-2分子标记可检测7B位点3种基因型Psy-B1a、Psy-B1b和Psy-B1c。其中等位基因Psy-A1b和Psy-B1b都与低YP含量相关，它们在277份材料中的出现频率分别是39.7%和55.6%，而在各省间的频率变化较大。Psy-A1b在河南和山东地区出现频率最低，分别为15.7%和13.3%，在江苏品种中频率最高，为71.2%，在湖北、四川和陕西品种中频率递减，范围为57.%～66.7%。等位基因Psy-B1b在江苏品种中频率却最低，为25.0%，山东地区也较低，为36.7%。陕西和河南地区该基因型频率较高，分别为81.0%和78.6%。

Psy-B1c基因型与高YP含量相关，该基因型在各地区小麦中的频率都很低，出现频率范围为0～9.5%，供试材料中河南和四川品种中未检测到该基因型。

2.4 等位变异组合分布情况分析

Ppo-2A和Ppo-2D位点基因型两两组合可形成4种组合类型，等位变异组合Ppo-A1b/Ppo-D1a的PPO活性最低，供试材料中该组合出现频率为34.7%，高于4种组合类型的平均值25%。在各省份中，四川地区该组合频率最高，达60.0%，而陕西品种频率最低，为14.3%，与陕西品种中Ppo-D1a的出现频率相同。Ppo-A1b/Ppo-D1a组合基因型在河南地区频率为25.7%，与4种组合类型的平均值25%相当，其他3省中该组合出现频率都高于平均值25%。

PSY基因在7A位点的2种基因型和7B位点的3种基因型两两组合可形成6种组合类型，其中等位变异组合Psy-A1b/Psy-B1b对应的YP含量最低，该组合在277份小麦品种（系）中出现频率为22.2%，高于6种组合类型的平均值16.7%。在各省份中，低YP含量組合Psy-A1b/Psy-B1b在陕西地区频率最高，为52.4%；四川和湖北次之，分别为50.0%和45.5%；山东地区最低，只有6.7%；河南和江苏品种（系）中该组合频率略低于6种组合类型的平均值16.7%。

组合类型Ppo-A1b/Ppo-D1a/Psy-A1b/Psy-B1b/non 1B/1R的YP含量和PPO活性相对最低，是筛选优良色泽品种的最优组合类型。供试材料中该组合类型出现频率为5.8%，是组合类型平均值2.1%的2倍多；四川地区频率最高，达25.0%；湖北次之，频率为12.1%，山东品种中最低，未检测到该组合类型。

3 小结与讨论

通过对PPO活性和YP含量相关基因型的分子检测，6个省份基因型的出现频率差异很大。低PPO活性基因型Ppo-A1b出现频率范围为28.6%～65.0%，Ppo-D1a频率范围为14.3%～85.0%，其组合的基因型频率范围在14.3%～60.0%。低YP含量基因型Psy-A1b的频率范围为13.3%～71.2%，Psy-B1b的频率范围为25.0%～81.0%，其组合的基因型频率范围为6.7%～52.4%。因此，为了培育低PPO活性和低YP含量的小麦品种，不同地区在选育策略上可因地制宜。

河南品种中控制低PPO活性和低YP含量的4种基因型频率非常有特点。Ppo-A1b频率很低，为6个省份中最低，仅28.6%，而Ppo-D1a基因型频率较高，为77.1%。该结果与左爱辉等[12]的报道较一致（文献中Ppo-A1b为27.8%，Ppo-D1a为70.8%）。陈杰等[13]和杨子博等[14]的报道中也证实河南省品种Ppo-A1b频率很低，分别为28.6%和19.8%，但这两篇报道中Ppo-D1a的频率低一些，分别为59.5%和56.0%。河南品种中低YP含量基因型Psy-A1b频率很低，仅15.7%，但Psy-B1b的分布频率较高，达78.6%。因此，河南地区在育种中需加强Ppo-A1b和Psy-A1b基因型的选择，就能有效降低品种的PPO活性和YP含量。

江苏品种中控制低PPO活性和低YP含量的4种基因型中，仅基因型Psy-B1b频率为25.0%，在6个省份中垫底，其他3种基因型出现频率都较高，分别为63.5%、73.1%和71.2%。Ppo-A1b和Ppo-D1a频率比杨子博等[14]的报道要高些。该省Ppo-A1b/Ppo-D1a、Psy-A1b/Psy-B1b组合类型频率以及non 1B/1R频率都高于河南省，但其最优组合类型Ppo-A1b/Ppo-D1a/Psy-A1b/Psy-B1b/non 1B/1R却低于河南省。所以，江苏品种在增加Psy-B1b基因型选择的同时，需提高这些优良等位基因的聚合。

湖北品种中1B/1R易位系频率最低，仅15.2%。低PPO活性和低YP含量相关4种基因型的出现频率都比较高，范围为60.6%～69.7%，Ppo-A1b/Ppo-D1a和Psy-A1b/Psy-B1b组合类型频率也较高，分别为42.4%和45.5%，只是最优组合Ppo-A1b/Ppo-D1a/Psy-A1b/Psy-B1b/non 1B/1R的频率稍低。因此，湖北品种可进一步提高有利基因型的频率，并加速这些基因型的聚合，从而增强品种色泽品质。

山东品种中Ppo-A1b频率为63.3%，与陈杰等[13]和杨子博等[14]的报道一致，但等位基因Ppo-D1a的频率差异较大，本研究中结果为50.0%，两篇报道中分别是35.5%和65.7%。山东品种中与低YP含量相关的Psy-A1b和Psy-B1b基因型出现频率都很低，分别为13.3%和36.7%，造成Psy-A1b/Psy-B1b组合频率仅6.7%。郭凤芝[15]也证实山东品种Psy-A1b频率很低，为16.67%，因此，山东品种需要着重提高Psy-A1b和Psy-B1b基因型频率，同时Ppo-D1a基因型频率也有待提高。endprint

陕西品种中Ppo-D1a频率非常低，为14.3%。邓彪等[16]和付晓洁等[17]的报道中也证实了陕西自育品种中Ppo-D1a的分布较少，频率分别为32.43%和30.4%。但杨子博等[14]的报道中却较高，为65.2%，推测这些差异跟供试材料选择有关。Psy-A1b和Psy-B1b基因型在陕西品种中频率较高，分别为57.1%和81.0%。与报道大体一致，频率范围在50.0%～67.4%[18，19]。陕西品种中1B/1R易位系频率也较高，大大降低了最佳组合的出现频率。因此，陕西地区需重点关注Ppo-D1a基因型频率的提高，并降低易位系频率，从而增加多个有利基因型的聚合。

四川品种中4种有利基因型的频率都较高，特别是Ppo-D1a基因型频率达85.0%。陈静等[20]报道Ppo-D1a频率为83.6%，与本研究结果一致。李式昭等[21]的报道中略低，分布频率为74.3%。可见四川品种中Ppo-D1a基因型频率普遍较高。另外，Ppo-A1b、Psy-A1b和Psy-B1b基因型频率在这两篇报道中都低于本研究结果。4种有利基因型的聚合概率也较高，四川品种Psy-A1b和Psy-B1b基因型频率都低于湖北品种，但Psy-A1b/Psy-B1b组合的频率却高于湖北品种。因此，对于四川品种，可进一步提高Ppo-A1b、Psy-A1b和Psy-B1b基因型的频率。

综上所述，四川品种中与低PPO活性及低YP含量相关基因型频率都较高，湖北省次之，其他4省各有需要着重选择的基因型。各省可以根据上述品种色泽相关等位基因分布特点制定具体育种策略，并在提高有利基因型频率的同时，加速有利基因型的聚合，才能更好地改善品种色泽，达到培育优质色泽品种的目的。

参考文献：

[1] FEILLET P，AUTRAN J C，ICARD-VERNI？魬RE C. Pasta brownness：an assessment[J].J Cereal Sci，2000，32：215-233.

[2] FUERST E P，ANDERSON J V，MORRIS C F. Delineating the role of polyphenol oxidase in the darkening of alkaline wheat noodles[J].J Agric Food Chem，2006，54：2378-2384.

[3] 郑文寅，汪 帆，司红起，等.普通小麦籽粒LOX、PPO活性和类胡萝卜素含量变异及对全麦粉色泽的影响[J].中國农业科学，2013，46（6）：1087-1094.

[4] 王 蕾，高 翔，陈其皎，等.小麦PPO基因等位变异及面粉白度特性分析[J].西北农业学报，2012，21（12）：11-19.

[5] GALLAGHER C E，MATTHEWS P D，LI F，et al. Gene duplication in the carotenoid biosynthetic pathway preceded evolution of the grasses[J].Plant Physiol，2004，135：1776-1783.

[6] HE X Y，ZHANG Y L，HE Z H，et al. Characterization of a phytoene synthase 1 gene（Psy1） located on common wheat chromosome 7A and development of a functional marker[J].Theoretical and Applied Genetics，2008，116（2）：213-221.

[7] HE X Y，HE Z H，MA W，et al. Allelic variants of phytoene synthase 1 （Psy1） genes in Chinese and CIMMYT wheat cultivars and development of functional markers for flour color[J].Molecular Breeding，2009，23：553-563.

[8] SUN D J，HE Z H，XIA X C，et al. A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in bread wheat[J].Molecular Breeding，2005，16（3）：209-218.

[9] HE X Y，HE Z H，ZHANG L P，et al. Allelic variation of polyphenol oxidase（PPO） genes located on chromosomes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat[J].Theoretical and Applied Genetics，2007，115（1）：47-58.

[10] FRANCIS H A，LEITCH A R，KOEBNER R M D. Conversion of a RAPD-generated PCR product，containing novel dispersed repetitive element， into a fast and robust assay for the presence of rye chromatin in wheat[J].Theoretical and Applied Genetics，1995，90（5）：636-642.

[11] 陈 泠，高春保，佟汉文，等.小麦黄色素含量、多酚氧化酶活性和1B/1R异位相关基因的分子标记检测[J].湖北农业科学，2016，55（23）：6050-6054.

[12] 左爱辉，陈 锋，尚晓丽，等.河南小麦新品种（系）的多酚氧化酶基因等位变异[J].麦类作物学报，2012，32（6）：1072-1077.

[13] 陈 杰，陈 锋，詹克慧，等.黄淮麦区小麦子粒多酚氧化酶活性基因等位变异的分子检测[J].植物遗传资源学报，2013， 14（5）：900-907.

[14] 杨子博，顾正中，周羊梅，等.黄淮麦区小麦品种PPO活性基因等位变异的检测及分布[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2016，37（3）：95-100.

[15] 郭凤芝.PPO和PSY基因不同等位变异在山东小麦中的分布及其表达载体的构建[D].山东泰安：山东农业大学，2009.

[16] 邓 彪，屈国胜，王 茹，等.陕西省地方小麦品种多酚氧化酶基因等位变异检测及分布[J].分子植物育种，2009，7（3）：478-482.

[17] 付晓洁，叶 石，吴学闯，等.多酚氧化酶活性基因等位变异在陕西小麦品种中的分布[J].麦类作物学报，2009，29（2）：236-240.

[18] 杨松杰，张影全，王 茹，等.陕西省地方小麦品种黄色素含量基因的遗传分析[J].华北农学报，2010，25（4）：83-87.

[19] 张影全，付晓洁，张晓科，等.陕西小麦品种（系）籽粒黄色素含量基因的检测及其分布[J].麦类作物学报，2010，30（3）：421-426.

[20] 陈 静，张晓科，何中虎，等.面条品质性状相关基因在四川小麦中的分布[J].麦类作物学报，2007，27（6）：1010-1015.

[21] 李式昭，郑建敏，伍 玲，等.四川小麦品种淀粉特性、多酚氧化酶活性和黄色素含量相关基因的分子标记鉴定[J].分子植物育种，2015，13（5）：982-993.endprint