黄薇+袁斌+金利容+刘友梅+万鹏
摘要:以大丽轮枝菌(Verticillium dahilae)V991b和V991w为研究对象,研究其在PDA培养基上的培养性状、温度对其生长发育的影响及其对棉苗的致病力。结果表明,两种病原菌的生长曲线基本呈线性关系。25 ℃下,V991b和V991w菌株在PDA培养基上培养16 d后菌落直径之间差异不显著,且在培养过程中二者之间的生长速率差异不显著。培养温度会影响病原菌表型的变化,30 ℃下V991b中微菌核数量明显减少,培养性状逐步接近于V991w,而V991w形态上不发生变化,PDA培养基中培养16 d V991b和V991w菌落生长直径有显著性差异。35 ℃下,V991b不生长,V991w菌落呈膜状,生长形态类似酵母菌。V991w对高温的耐受显著强于V991b。温度对V991b微菌核的产生有明显影响,35 ℃以上的高温与5 ℃以下的低温都不利于微菌核的产生。查氏液体培养基摇菌后接种棉苗,接种25 d后,两种病原菌的致病力差异显著,分别为48.869和21.777。
关键词:大丽轮枝菌(Verticillium dahilae);培养性状;致病力;变异体
中图分类号:S432.4+4 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2017)24-4777-05
大丽轮枝菌(Verticillium dahilae Kleb.)是一种土传性的病原菌,在世界范围内对多种大田作物、蔬菜、水果、紫荆和榆树等园林植物都造成不同程度的危害,并且还在逐年扩大[1]。大丽轮枝菌的变异程度高,微菌核的抗逆性强,存活时间长,一旦定殖下来就很难清除。由于大丽轮枝菌的变异性强,在与寄主协同进化的过程中常发生生理分化,产生新的致病类型或生理小种,这种变异性为棉花抗病品种的选育和对黄萎病的防治都造成了极大的困难。抗病品种的缺乏、肥料的滥用导致土壤中微生物生态失衡、气候环境的变化等多方面的影响,使它上升成了棉花上的一种主要病害,轻则导致棉花减产,严重情况下会导致大面积的棉田绝收[2,3]。对大丽轮枝菌的研究多集中在对于同一地区或者不同地区的致病型分化和致病力鉴定上,不同地区病原菌之间的致病力差异非常显著,同一棉田中病原菌的致病力也有较大差别[4],甚至同一病株上分离得到的病原菌致病力之间也存在较大差异[5]。因为病原菌在遗传背景上有较大差异,各地分离得到的单株之间并无可比性。湖北省农业科学院植保土肥研究所棉病实验室在继代过程中从大丽轮枝菌菌株V991中得到一株突变菌株V991w,对突变株经过多次继代培养后,发现其表现为菌丝型,气生菌丝茂盛,且其性状可稳定遗传。经查氏培养基培养产孢后接种,其致病力明显弱于V991,经过rDNA-ITS分子鉴定表明突变株和对照菌株的DNA序列完全相同,但在PDA培养基中二者的生物学特性及致病力完全不同。本研究希望在同一遗传背景条件下,从菌株的基本生物学特性入手,以野生型V991b及其突變株V991w为研究对象,调查其生物学性状和致病力,以期找到影响病原菌表型和可能与致病力相关的因子,为深入研究病原菌的致病机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 野生型V991b为菌核型菌株,由华中农业大学作物遗传改良育种国家重点实验室惠赠;V991w为湖北省农业科学院植保土肥研究所棉病实验室在PDA培养条件下从V991b菌落中分离得到的突变体,为菌丝型菌株,每2周继代一次,用5 mm打孔器于菌落外缘生长旺盛的区域打取菌饼,其性状经过多次继代后可稳定遗传。将V991w保种到PDA斜面后置于4 ℃保种,再接种到25 ℃ PDA培养基中,仍表现为菌丝型菌株。
1.1.2 鉴别寄主及种植情况 鉴别寄主有冀棉11、豫棉2067、鲁棉28,均为常规棉。冀棉11为感病品种,豫棉2067为耐病品种,鲁棉28属于抗病品种。采用无土基质育苗,使室温保持在22~28 ℃,棉花种子经硫酸脱绒和双氧水表面消毒后,置于平皿中以无菌水浸泡2~4 h。种子泡好后,分行播种,播种到浸润均匀的基质中,保持湿度,保证温室自然通风,勤加管理。待棉苗长到2~3片真叶时采用裸苗伤根法接种病原菌。
1.2 方法
1.2.1 培养基 供试培养基为PDA培养基,其制作参照文献[6],去皮马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂 15 g,去离子水1 000 mL。将去皮的马铃薯切碎,加水煮沸30 min,用纱布滤去马铃薯,加水补足1 000 mL,加糖和琼脂,加热使琼脂完全熔化,趁热用纱布过滤,分装至锥形瓶中,121 ℃灭菌20 min。
1.2.2 PDA培养基培养病原菌的形态结构及菌落形态的观察 将V991b和V991w用打孔器取菌落外缘生长旺盛的区域打取5 mm菌饼,分别接种于PDA平皿,25 ℃下黑暗静置培养15 d后,用电子显微镜分别观察其形态结构和菌落特征。
1.2.3 PDA培养基上温度对大丽轮枝菌微菌核产生的影响 在直径为90 mm的培养皿中每皿倒入20 mL PDA培养基,接入20 μL浓度为106 CFU/mL的孢子悬浮液,倒置静置。同一菌株重复3皿,分别置于5、25、30、35 ℃的培养箱中暗培养,每天显微镜下观察,记录不同处理大丽轮枝菌微菌核产生的情况。
1.2.4 PDA培养基对大丽轮枝菌生长速率的影响 选取纯化培养后的大丽轮枝菌,接种到PDA培养基,同一菌株重复3皿,于25 ℃下倒置暗培养,每隔1 d以十字交叉法测定其菌落直径,持续调查两周。
1.2.5 病原菌致病力调查 将V991b和V991w接种到Czapek(查氏)培养液中,于25 ℃条件下,180 r/min摇菌7 d,获得菌悬液,经过双层滤纸真空抽滤,配制成浓度为10^7CFU/mL的孢子悬液。采用浸根法接种棉苗。接种前将棉苗慢慢托起,不致大量伤根和伤苗。每个品种至少取60棵苗,将3个鉴别品种分开标记,保持根部基本整齐一致,然后置于同一菌系的菌悬液中,使根能够充分接触到菌液。裸苗浸根接种30 min,移栽到营养钵中。每个营养钵中4~5株棉苗,置于温室中,室温保持22~28 ℃,自然通风,精心管理[4]。endprint
1.3 数据分析
采用DPS单因素方差和Duncans新复极差测验的多重比较分析试验数据。
2 结果与分析
2.1 PDA培养基上病原菌的形态结构及菌落形态
由图1可知,从菌落形态上看,在PDA培养基上,V991b为菌核型菌落,正面有明显可见的白色气生菌丝遍布于菌落表面,菌落边缘菌丝呈枝状,背面菌落呈黑色,菌落轮纹不明显。大约经过6~7 d出现肉眼可见的黑色素;V991b的产孢量高于V991w,气生孢子产生多且量大,典型的轮枝状结构非常清晰,4、5个孢子丛生,且微菌核分散。从电子显微镜上来看,微菌核为多个厚壁的黑色细胞集结形成,纠结成一团,在外缘有部分呈半透明状的细胞。
由图2可知,V991w在PDA培养基上表现为菌丝型菌落,正面有浓密的气生菌丝,平铺在菌落表面,背面呈白色,无轮纹。在PDA培养基上形成的菌落质地致密,结构紧凑;V991w的气生孢子较少,稀疏分布,镜检结果发现菌丝占大多数,气生孢子相对来说较少,同样存在轮枝状结构,但数量少,没有微菌核。
2.2 温度对大丽轮枝菌微菌核产生的影响
将野生型V991b和突变株V991w接种到PDA培养基上,分别倒置于5~35 ℃的恒温箱中暗培养15 d,其培养性状及菌落直径结果见图3、图4、表1。结果表明,5 ℃条件下,V991w生长速度极慢,V991b几乎不生长。说明低温明显抑制V991b和V991w的生长。25 ℃条件下,15 d后两种病原菌菌落生长直径无明显差异,且在生长过程中V991b和V991w差异也不明显(图1)。30 ℃条件下,V991b只在平皿中央出现少量黑色素,随着培养时间的延长黑色素所占比例减少,气生菌丝多且浓密,培养性状逐步接近V991w;而V991w形态上不发生变化,但生长速度稍慢于V991b;V991w平均生长速率为2.3 mm/d,而V991b的平均生长速率为2.6 mm/d。培养15 d,V991b直径达到4.0 cm,V991w直径达到3.5 cm。35 ℃条件下,V991b不生长,V991w气生菌丝消失,菌落呈膜状紧贴于培养基表面,表面为淡黄色,类似酵母菌的形态(图3)。
由表1可知,15 ℃条件下,微菌核产生数量最多,且极显著多于其他温度,但25 ℃条件下产生微菌核的直径最大,高温会导致微菌核数量的下降(图4)。温度对野生型V991b微菌核的产生有明显影响,35 ℃以上的高温与5 ℃以下的低温都不利于微菌核的产生,微菌核产生的最适温度为15~25 ℃,此温度区间微菌核的数量较其他温度有明显提升。
高于30 ℃条件下,V991b培养性状逐步接近于V991w;而V991w形态上不发生变化,35 ℃条件下,菌核型菌株停止生长,菌丝型菌株表型发生变化,长期的高温胁迫会导致病原菌的表型发生变异。温度试验结果表明,菌丝型菌株V991w对高温的耐受能力强于菌核型菌株V991b。
2.3 病原菌生长速率的测定
从供试菌株的菌落边缘取直径约2~3 mm的菌丝块,分别接种到PDA培养基的平皿中央,于25 ℃恒温培养箱内黑暗培养,3次重复,15 d后测量菌落直径。调查结果见图5。25 ℃条件下,培养16 d,在PDA培养基上,V991b和V991w的菌落生长直径分别为5.833和6.167 cm;DPS的单因素方差和Duncans新复极差测验的多重比较分析结果表明,PDA培养基中强弱菌株菌落的生长速率差异不明显,菌株直径间的差异不显著。
由图6可知,30 ℃条件下,培养16 d,V991w平均生长速率为2.27 mm/d,而V991b的平均生长速率为2.60 mm/d,V991b和V991w的菌落生长直径分别为4.037和3.562 cm。DPS的单因素方差和Duncans新复极差测验的多重比较分析结果表明,接菌后16 d,PDA培养基中强弱菌株菌落的生长速率间差异明显,而菌株直径间差异显著。
2.4 病原菌致病力的测定
经查氏培养基摇菌后调查结果如表2所示,接种5~7 d棉苗开始显现病症,接种后7 d,V991b和V991w的平均病情指数分别为5.151和7.121。随着接种时间的推移,棉苗的病情指数逐渐上升。接种后15 d,V991b和V991w的病情指数出现明显的差异,V991b的病情指数为25.109,V991w的病情指数为13.771,V991b的病情指数几乎达到V991w的两倍。接种后25 d,V991b的平均病情指数为48.869,V991w的平均病情指数为21.777。15 d后的病情调查表明,菌核型菌株(V991b-CA)的致病力明显强于菌丝型菌株(V991w-CA)的致病力。
3 小结与讨论
3.1 温度和培养条件会影响病原菌的表型
白应文等[7]发现受试菌株在不同温度下产生微菌核的数量及直径间存在显著差异,20 ℃时产生的微菌核数量最多且个体最大。将多个菌株置于(20±1) ℃,菌株的病情指數与其产生微菌核的数量及直径间均无相关性。在本试验中微菌核在10~30 ℃条件下均能出现,过高温度(30 ℃)或过低温度(10 ℃)会明显减少微菌核的数量,长时间处于30 ℃以上的培养条件下,微菌核会减少甚至消失。微菌核产生的最大直径与其他研究人员不同,可能是与菌株的个体差异性有关,相同地区的黄萎病菌菌株之间微菌核的大小也存在较大差异,如XJ592和XJ511菌株的微菌核大小分别为62.09和51.37 μm[7]。大丽轮枝菌的微菌核作为一种抗逆性结构,用来抵御不良环境对病原菌产生的影响[8],丰富的营养条件可能不利于微菌核的产生,导致大丽轮枝菌发生退化或突变。大丽轮枝菌在进行室内培养时非常容易发生角变,也可能与真菌的培养条件有关系[9,10]。在试验过程中发现,经PDA培养基上多次继代后,V991b菌株会出现退化现象,菌落表面气生菌丝少,微菌核数量明显减少,会变成仅有少量微菌核的中间型菌落,但随着培养时间的延长仍会转化为菌核型菌株。endprint
白应文等[7]通过比较培养基发现,将BM培养基中葡萄糖用量减半,并在培养基表面覆盖玻璃纸,可使大丽轮枝菌的微菌核产量提高3.7倍,表明在营养优越的条件下,作为抗逆性结构的微菌核产量可能会下降,与本试验的观察是一致的。
3.2 产生致病力变化的可能原因
对于以机械力侵染寄主组织的病原菌来说,如稻瘟菌、炭疽病菌等,附着孢中产生沉积的黑色素是病菌具有致病性和侵入寄主的前提,黑色素化的附着孢外壁能使病原菌积累足够的膨压穿透寄主表皮[11]。黑色素还可以有效清除活性氧自由基,保护生物体DNA免受辐射伤害。黑色素对菌丝的生长和繁殖不起作用,但可以加强真菌在不良环境条件下的生存和竞争能力,保护微生物免受紫外线和溶菌酶等的作用[12]。Lee等[13]研究发现黑色素可以加固细胞壁,提高分生孢子和菌丝对寄主免疫系统的抵抗力,增强病原菌的侵染能力。但在大丽轮枝菌中,黑色素与致病力之间无相关性,白色菌丝型菌株也有致病力强的菌株[14]。
在室内25 ℃培养条件下,突变株V991w和野生型V991b的生长速率并没有明显差异,经查氏液培养接种棉苗后,致病力有显著变化,培养25 d时V991b平均病情指数为48.869,V991w平均病情指数为21.777。有研究认为微菌核的黑色细胞是病原菌度过逆性胁迫的关键结构,而半透明细胞可在适宜条件下进行菌丝萌发[15]。培养基条件会影响大丽轮枝菌的表型和微菌核数量,但对野生型V991b和突变株V991w的显微结构有无影响尚未知晓。当菌株长期处于营养丰富条件时,微菌核中的黑色细胞数量逐渐减少,产生退化,与菌丝萌发生长相关的半透明细胞纠结成团,形成主要结构,从而导致突变株的表型和致病力发生改变;或者是受丰富培养基诱导,致使病原菌基因组序列上的某些基因表达量发生变化,导致菌株的表型和致病力发生变化。菌株致病力的变化是由病原菌在寄主植物内的数量差异导致的,还是由于病原菌对植物的侵染力改变导致的,还需试验进一步验证。
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