隐丹参酮对乳腺癌MDA—MB—231细胞迁移、侵袭的影响及其机制

周南阳+赵虹

[摘要] 目的 探讨隐丹参酮对乳腺癌MDA-MB-231細胞迁移、侵袭的影响及其机制。 方法 用不同浓度的隐丹参酮处理 MDA-MB-231 细胞24 h。采用 MTT、划痕实验和Transwell侵袭实验测定不同浓度隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性、迁移和侵袭的影响。采用Western blot检测MDA-MB-231细胞中c-Src、p-c-Src Tyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2蛋白表达水平。 结果 与0 μmol/L对照组相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L隐丹参酮组对 MDA-MB-231 细胞存活率显著降低，且呈剂量依赖（P<0.05）。与对照组相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L隐丹参酮组对MDA-MB-231 细胞迁移、侵袭率均显著降低，且呈剂量依赖（P<0.05）。Western blot结果显示，与对照组相比，不同浓度组经隐丹参酮处理的 MDA-MB-231 细胞，MMP2蛋白水平和 c-Src、FAK蛋白的磷酸化水平均显著下调（P<0.05）。 结论 隐丹参酮可抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231 细胞活性、迁移和侵袭，其机制可能与其下调c-Src/FAK通路和MMP2表达有关。

[关键词] 隐丹参酮；乳腺癌；MDA-MB-231细胞；迁移；侵袭

[中图分类号] R273 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）35-0016-05

[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Cryptotanshinone on migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of Cryptotanshinone for 24 h. The effects of Cryptotanshinone on cell viability， migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells were assessed by MTT assay， wound healing assay and Transwell invasion assay. The protein levels of c-Src， p-c-Src Tyr416， FAK， p-FAK Tyr576/577， MMP2 were detected by Western blot. Results The results showed that 5 μmol/L， 10 μmol/L， 20 μmol/L， 40 μmol/L Cryptotanshinone groups significantly reduced the viability ability of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner， compared with the control group（P<0.05）. 5 μmol/L， 10 μmol/L， 20 μmol/L Cryptotanshinone groups significantly inhibited the the abilities of migration and invasion of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner， compared with the control group（P<0.05）. The result of Western blot showed that Cryptotanshinone inhibited the expression of MMP2 and the phosphorylation of c-Src、FAK in a dose-dependent manner in MDA-MB-231 cells（P<0.05）. Conclusion These results suggest that Cryptotanshinone may suppress the viability， migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells by inhibiting c-Src/FAK pathway and the expression of MMP2.

[Key words] Cryptotanshinone； Breast cancer； MDA-MB-231 cells； Migration； Invasion

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增加，目前居女性癌死亡率的第一位[1]。其中，全世界每年约1000 000乳腺癌新增病例中超过17%的患者为三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）[1-2]。三阴性乳腺癌是指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）与人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor- 2，Her-2）均为阴性的一类乳腺癌[1-3]。由于其恶性程度和侵袭性高，易在短期内复发转移，且其对雌、孕激素受体表达阳性和Her-2过表达的乳腺癌的靶向治疗不敏感，因此生存率比非三阴性乳腺癌差[2-3]。目前，三阴性乳腺癌治疗方法研究成为国际上乳腺癌研究的热点之一[1-3]。隐丹参酮（cryptotanshinone）是从唇形科植物丹参根中提取分离的二萜醌类有效单体，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物学活性和药理效应[4-5]。近来文献报道，隐丹参酮具有抑制乳腺癌细胞增殖、迁移等作用，然而有关隐丹参酮对乳腺癌细胞迁移和侵袭的作用及其机制目前尚不完全清楚[6]。本研究以三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象，用不同浓度隐丹参酮干预，检测其活性、迁移和侵袭能力，检测迁移、侵袭相关分子基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）表达水平和c-Src 激酶、黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）磷酸化水平，从而观察隐丹参酮对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响，并初步探讨其机制，现报道如下。endprint

1 材料与方法

1.1 材料来源

乳腺癌 MDA-MB-231細胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；隐丹参酮购自成都曼思特生物科技有限公司（纯度>98%）（图1）。将隐丹参酮溶于DMSO配制成等20 mmol/L的储备液，分装后于-20℃储存，避光保存；使用时用无血清 RPMI 1640 培养液稀释为5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L的工作液，DMSO终浓度为 0.1%，对照组为含0.1% DMSO的细胞培养液。胎牛血清和 RPMI 1640 培养基购自Hyclone 公司；兔抗人 c-Src、p-c-SrcTyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2和 β-actin 抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG购自 Cell Signaling Technology公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自美国Bio-Rad公司；Transwell 小室购自Corning公司；Matrigel基质胶购自美国 BD 公司；结晶紫染色液和RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 乳腺癌 MDA-MB-231 细胞在37℃，5% CO2条件下，常规培养于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基。待细胞长满至80%左右单层时，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、传代，取生长良好的细胞进行实验。

1.2.2 MTT法检测细胞活性 取MDA-MB-231细胞，接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，细胞数1×104/孔，每组5个复孔。培养 24 h后，吸弃原培养液，各孔分别加入 200 μL 含有不同浓度隐丹参酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L），同时设调零孔。继续培养24 h后，利用 MTT 法在波长 490 nm 处检测各组样品吸光度值（A490）。细胞存活率=（实验组A值-对照组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%，对照组定义为 100%。实验重复3次。

1.2.3 细胞划痕迁移实验 取对数生长期MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，1×106/孔，待细胞长满后，更换为不同浓度隐丹参酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）继续培养24 h。然后用20 μL枪头于每孔中间做一划痕，用PBS将未贴壁的细胞洗去，加入2 mL无血清 RPMI 1640 培养液，划痕后24 h，于显微镜下拍照并计数迁移细胞数量，对照组定义为100%。实验重复3次。

1.2.4 Transwell侵袭实验 取对数生长期MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，1×106/孔，待细胞融合至 80%时，更换为不同浓度隐丹参酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）继续培养24 h。预先将基质胶用RPMI1640 培养基以 1：7～1：8 稀释后，每个小室内加入 50 μL，4℃风干过夜，然后小心吸出小室内残余液体，每孔加 50 μL无血清培养液，置于 37℃孵箱内，放置 30 min备用。取密度为 4×105/mL的各组细胞悬液100 μL加入上室内，每组均设复室。在下室中加入600 μL含10%FBS的RPMI 1640培养基，37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉签擦去上室内的细胞和基质胶，用PBS清洗两遍，4%的多聚甲醛固定液固定 30 min，1%结晶紫溶液中染色15 min，PBS 洗涤3次，风干，取下Insert膜，封片后在显微镜高倍镜下，随机选取10个视野，对侵袭至膜背面的细胞总数进行计数并拍照，取均值。对照组定义为 100%。实验重复3次。

1.2.5 Western blot检测蛋白水平 取对数生长期MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，1×106/孔，待细胞融合至80%时，更换为不同浓度隐丹参酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）继续培养24 h，收集细胞，4℃预冷的PBS洗涤3次，加入75 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，bradford法测蛋白质浓度。取25 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至 PVDF 膜，用5%BSA/TBST封闭液室温下封闭1 h，洗膜后加入抗 c-Src、p-c-SrcTyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2和 β-actin-抗（1∶1 000稀释），4°C孵育过夜，TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶1 000 稀释）室温下孵育2 h，TBST洗膜3 次，将化学发光增强液A和B等体积混匀涂抹于PVDF膜上，用Bio-Rad凝胶成像系统获取图像。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni 校正的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性的影响

用MTT法检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性的影响，结果显示，在隐丹参酮作用24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组对MDA-MB-231细胞活性的抑制率分别为（12.22±1.04）%，（22.93±0.83）%，（37.51±1.00）%，（50.59±0.48）%。与对照组相比，各浓度隐丹参酮组对MDA-MB-231细胞存活率显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。两两比较结果显示，各浓度之间差异有统计学意义（P<0.05），表明隐丹参酮可显著抑制MDA-MB-231细胞活性，且呈剂量依赖（图2）。endprint

2.2 隐丹参酮抑制MDA-MB-231细胞迁移情况

用划痕实验检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞迁移的影响。结果显示，隐丹参酮处理后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L组对MDA-MB-231细胞迁移的抑制率分别为（29.01±1.85）%，（51.23±4.05）%，（68.72±2.49）%。与对照组相比，各浓度隐丹参酮组对MDA-MB-231细胞迁移率显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。两两比较结果显示，各浓度之间差异有统计学意义（P<0.05），表明隐丹参酮可显著抑制MDA-MB-231细胞迁移，且呈剂量依赖（图3）。

2.3 隐丹参酮抑制MDA-MB-231细胞侵袭情况

用Transwell侵袭实验检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞侵袭的影响。结果显示，隐丹参酮处理后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L组对MDA-MB-231细胞侵袭的抑制率分别为（58.00±4.30）%，（68.10±1.94）%，（78.09±2.05）%。与对照组相比，各浓度隐丹参酮组对MDA-MB-231细胞侵袭率降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。两两比较结果显示，各浓度之间差异有统计学意义（P<0.05），表明隐丹参酮可显著抑制MDA-MB-231细胞侵袭，且呈剂量依赖（图4）。

2.4 隐丹参酮对MMP-2蛋白表达及c-Src、FAK蛋白磷酸化的影响

用Western blot检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭密切相关分子MMP2 表达水平和c-Src、FAK磷酸化水平。结果显示，在隐丹参酮作用24 h后，与0 μmol/L对照组相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L组MDA-MB-231细胞中MMP2 表达水平和c-Src、 FAK蛋白磷酸化水平均显著下降（P<0.05），且各浓度之间差异有统计学意义（P<0.05）（图 5、表1）。

3 讨论

隐丹参酮是中药丹参根中提取的二萜醌类有效单体，因其具有菲并呋喃结构且D环上C15与C16之间为单键而呈现独特的藥理活性，且其药动学特征符合二室开放模型，是近年来国内外学者对中药单体中研究较多的活性成分之一[7]。已有实验证实，隐丹参酮可有效抑制肿瘤细胞增殖、侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成，从而发挥其抗肿瘤的作用[4]。新近研究报道，隐丹参酮可通过抑制MMP2和MMP9的表达抑制卵巢癌细胞迁移、侵袭，通过激活Caspase信号途径诱导卵巢癌细胞凋亡[8]。Shen L等[9]研究发现在体内外肝癌模型中，隐丹参酮可通过下调STAT3蛋白磷酸化，增加了Bcl-2的表达，降低了Bax的表达，从而增强三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡。本研究结果表明，隐丹参酮在体外可显著抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞活性、迁移和侵袭，且呈剂量依赖性。Western blot结果表明隐丹参酮显著抑制 MDA-MB-231细胞中c-Src和FAK 蛋白的磷酸化，同时下调MMP2蛋白表达，初步揭示了隐丹参酮抑制乳腺癌 MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的分子机制。目前有动物实验结果表明，在人肺癌裸鼠原位移植模型中，隐丹参酮能有效抑制肿瘤形成，诱导其凋亡，同时改善机体状况[10]。有关隐丹参酮体内抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的有效性与安全性有待进一步研究。另有文献报道，隐丹参酮可通过STAT3信号诱导胆管癌细胞、肾癌细胞凋亡[4]，有关隐丹参酮对乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响及其机制有待进一步研究。

c-Src是一种非受体型的酪氨酸激酶，由原癌基因 c-Src编码，分子量约为 60 kDa[11]。在正常细胞中，c-Src处于抑制状态；在癌变或处于有丝分裂期的细胞中，c-Src羧基端的Tyr530去磷酸化和Tyr 416自身磷酸化，使c-Src蛋白被完全活化。活化的 c-Src 将 FAK 磷酸化，然后二者形成复合物，诱导黏着斑翻转，介导肌动蛋白重塑，促进细胞迁移和侵袭[12]。c-Src在多种肿瘤细胞中高度活化和/或过量表达，如肝癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等[13]。研究发现，三阴乳腺癌常伴有c-Src的激活和过表达，与三阴乳腺癌的转移和进展密切相关[14]，而沉默 c-Src 基因表达可抑制人三阴乳腺癌 MDA-MB-231细胞迁移和侵袭[15]。在本研究中，我们发现5 μmol/L 隐丹参酮可显著抑制MDA-MB-231 细胞c-Src和 FAK 磷酸化水平，且随浓度增加作用增强。提示隐丹参酮可能通过下调c-Src/FAK通路抑制MDA-MB-231 细胞迁移、侵袭。

MMP2是基质金属蛋白酶家族的重要成员，其基因位于人类染色体16q21，分子量约为72 kDa，它能降解细胞外基质及基底膜，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用[16-17]。大量临床研究和实验研究表明，MMP2的高表达与肿瘤的转移及预后密切相关，如乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等[16-18]。有文献报道，下调MMP2 的蛋白表达可有效抑制 MDA-MB-231细胞迁移和侵袭[19-20]。在本研究中，我们发现5 μmol/L隐丹参酮可显著抑制MDA-MB-231细胞MMP2的表达，且随浓度增加作用增强。提示隐丹参酮可能通过下调MMP2表达抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭。

综上所述，隐丹参酮可抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞活性、迁移和侵袭，其机制可能与其下调c-Src/FAK通路和MMP2表达有关。本研究结果为隐丹参酮抗三阴乳腺癌的中药分子治疗提供了新的依据和线索。

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（收稿日期：2017-09-11）endprint