储藏稻谷中真菌的生长特性、监测及防控技术研究进展

张 威 周 涛 贺艳萍 王平坪 舒在习 孙朝军

(武汉轻工大学食品科学与工程学院1，武汉 430023) (大宗粮油精深加工省部共建教育部重点实验室2，武汉 430023) (湖北省农产品加工与转化重点实验室3，武汉 430023) (湖北中储粮粮油质量检验中心4，武汉 430311)

稻谷是全球三大主粮之一，在我国饮食结构中占据重要的地位。我国稻谷种植面积约为3 000万公顷，占全球种植面积的近20%。除粮食生产大国外，我国同时也是粮食消费大国，为保证粮食安全，国家在粮食战略上制定了储备粮政策[1-2]。2016年，我国稻谷总产量超2亿t，其中稻谷存储量超1亿t。因自身生理生化变化及与外界环境间的相互作用，稻谷储藏中可能遇到各种安全问题[3-4]。发现稻谷储藏过程中存在的风险因素，并开发针对性的解决方案，有效减少储藏损失一直是稻谷研究领域的热点方向。

真菌在人类生活的环境中无处不在。长久以来，真菌被认为是影响稻谷安全储藏的重要风险因素[5]。从生长到收储，稻谷与空气、水、土壤及动物等接触均可能伴有真菌的污染。在储藏环节，稻谷的储存环境并非孤立不动的，而是在不断变化的，真菌生长条件会随环境变化而改变。当环境条件适宜真菌生长，真菌大量生长、繁殖，引起稻谷发热、霉变及结块等不利变化。一些真菌在生长过程中会产生真菌毒素，在稻谷中残留后对人体危害极大[6-7]。为监测真菌生长，防止真菌在粮堆中进一步危害，科研人员及仓储企业在真菌活动规律、监测方法方面开展了大量的研究工作。如在真菌数量和种群结构监测方面，在传统的平板计数、孢子计数、镜检鉴定的基础上，研发出二氧化碳法、近红外法等一些新的方法。在掌握真菌活动规律及危害的同时，一些有效的防控手段也被针对性的研发并应用于稻谷储藏的不同环节。本文围绕真菌这一严重影响稻谷储藏安全的微生物，介绍了储藏中真菌的生长、监测及防控技术的现状及发展趋势，以期为其进一步研究提供参考。

1 储藏稻谷中真菌的种类及生长影响因素

1.1 真菌的种类

储藏稻谷中检出的真菌种类较多，但目前研究多集中在对粮食安全有重要危害的霉菌上。不同霉菌在稻谷中的数量存在差异，而且储藏期间菌种结构可能会发生改变。吴红萍等[8]在对海南稻谷粮库霉菌的调查中，检出单端孢霉属、镰刀霉属、木霉属、头孢霉属、交链孢霉属和曲霉属。李新社等[9]在对湖南储藏稻谷霉菌的污染调查中，主要检出的霉菌为曲霉属、青霉属和毛霉属，曲霉中主要带毒菌含量由高到低分别为黄曲霉、杂色曲霉及构巢曲霉。Oh等[10]对韩国11个地区的微生物调查中，发现曲霉和青霉是优势霉菌，其中前者在样品中的数量更多。Ok等[11]对韩国6个区域80份新收稻谷样品的霉菌调查中，发现镰刀菌属是优势菌，其次是青霉属、疱霉属、漆斑菌属、分子孢子菌属；另外，镰刀菌中，禾谷镰刀菌是优势菌种。都立辉等[12]在4个地区的淮稻5号稻谷中分离出真菌33株，主要包括青霉、曲霉和镰刀菌等菌属，其中青霉属与曲霉属为优势菌，分别为16株和15株，该稻谷25 ℃下模拟储藏6～8个月时出现的优势菌株为橘灰青霉。Pinciroli等[13]在12个月的稻谷储藏实验中发现，真菌检出频率由高到低顺序为田间真菌链格孢属、黑孢子菌属、附球菌属、离蠕孢属、弯孢属、枝孢菌属、镰刀菌属及储藏真菌青霉属、曲霉属，田间真菌主要分布在稻壳和糠层，储藏真菌主要分布在胚乳中，随储藏时间菌群结构动态变化。周建新等[14]发现稻谷霉变的优势菌主要是曲霉属，比较典型的有白曲霉、黄曲霉及米曲霉；储藏初期以田间真菌为主，储藏过程中，储藏真菌逐渐成为优势菌。

近年来的研究显示，霉菌的菌群结构变化与产区、储藏环境等因素有关。Makun等[15]对尼日利亚Niger州196份稻谷样品进行了真菌调查，不同霉菌在各稻谷样品中的检出数总和达1 062，发现主要的污染真菌属包括曲霉属、青霉属、镰刀菌属、链格孢菌属、白霉属、根霉属、木霉属、弯孢属、长蠕孢属、枝孢属，其中检测霉菌菌种最多的是青霉菌、黄曲霉、寄生曲霉菌、黑曲霉、毛霉、根霉、交链孢霉，热风、干热及雨季最常见的霉菌分别是黑曲霉、青霉和黄曲霉。Reddy等[16]在印度20个稻谷种植州收集的1 200个稻谷和大米样品(含525个大米样品)中进行曲霉调查，发现所有稻谷均可检出曲霉，其中黄曲霉、黑曲霉、赭曲霉及寄生曲霉是鉴定出的四种曲霉，不同地区曲霉的污染情况存在种类差异；对储藏条件进行统计，发现黄曲霉和黑曲霉是储藏期间的优势菌群，开放条件储藏(可以接触雨水)的样品中黄曲霉的污染程度明显高于正常储藏2～4年。杨基汉等[17]在模拟储藏中发现，稻谷的优势霉菌与稻谷初始水分有关，低初始含水量(10.6%和12.5%)稻谷储藏优势菌为黄曲霉，而高初始含水量稻谷(14.5%和16.6%)中白曲霉为优势菌。唐芳等[18]发现灰绿曲霉和白曲霉是稻谷储藏期间的优势危害真菌，稻谷含水量16.0%左右为两种曲霉生长优势的转折水分点，高于此水分后灰绿曲霉生长由强变弱，白曲霉生长由弱变强。

1.2 影响真菌生长的因素

稻谷中真菌(主要是霉菌)的生长与稻谷自身水分、储藏环境因子等密切相关。Adhikarinayake等[19]在钢混仓中对含水量14%新收获稻谷进行储藏的研究中，霉菌含量并未出现显著变化。Aydin等[20]对土耳其稻谷产区100份未包装稻谷的霉菌调查中，发现70份样品中霉菌含量在1×101～1.5×104CFU/g，霉菌含量与稻谷含水量显著正相关。周建新等[21]发现，储藏温度15 ℃和20 ℃下，稻谷中霉菌量变化较小，而温度超过25 ℃时稻谷储藏过程中水分散失较多，造成霉菌量下降。苏文焯等[22]发现，含水量12.0%和12.8%的稻谷可长期安全储藏，而含水量13.6%稻谷35 ℃以上储藏49 d就存在霉变风险；温度在15～40 ℃，霉菌生长速度与温度成正比。张海洋等[23]发现，稻谷含水量对真菌生长起决定作用，含水量13.1%低于真菌生长临界水分，温度适宜真菌也不生长；14.0%高于真菌生长临界水分，提高温度和水分均会加速真菌生长度越快。唐小俊等[24]发现，高温(30、35、40 ℃)条件下, 稻谷中霉菌含量随湿度上升而增加；高湿(75%、85%、95%)条件下，霉菌数量随温度升高而增加。Choi等[25]在韩国稻谷中分别接种黄曲霉和禾谷镰刀菌并在3种不同温湿度条件下(21 ℃/85%RH、21 ℃/97%RH、30 ℃/85%RH)储藏，发现黄曲霉在21 ℃/85%下无法生长，在另外2种条件下能生长，而禾谷镰刀菌仅在21 ℃/97%RH下可以生长。Ji等[26]研究了室内储藏稻谷中霉菌的生长规律，室内环境条件变化范围为温度22.6～27.0 ℃、相对湿度23.3%～44.2%，整个储藏期间霉菌数量稳定，优势菌包括白曲霉、黄曲霉、烟曲霉及青霉，总霉菌量与曲霉和青霉量均正相关，黄曲霉与总曲霉量和总霉菌量正相关。黄淑霞等[27]发现，稻谷水分活度升高将增强霉菌的活跃程度，另外，稻谷相比小麦和玉米显示出更强抗霉菌生长的能力。Mousa等[28]研究了两株不同黄曲霉菌(DISF10和DISF15)在稻谷中生长规律，发现水分活度0.82或温度10 ℃和43 ℃下，两株菌均无法生长；两株菌在15 ℃下生长情况不同，DISF10生长最低水分活度为0.92，而DISF15则不同；两株菌最适生长温度均在30～32 ℃。

2 储藏稻谷中真菌的监测方法

2.1 温度监测法

稻谷仓储实践中，管理不善容易引起霉菌生长微环境的变化，霉菌剧烈活动释放大量热量，导致局部粮温发生改变。粮库在入粮过程中，向粮堆中埋入测温电缆，监测粮堆不同部位的温度分布，经与仓温、气温及过往数据进行对比，判定粮温异常位点[29-30]。然而，粮堆中的发热不局限于霉菌活动，如昆虫的大量活动也会导致热量聚集，因此该法不具有专一性，在判断霉菌行为时需结合其他监测方法进行分析。另外，霉菌生长积聚的热量被测温装置检测到时，稻谷霉菌带菌量已经很大，因此通过粮温监测霉菌生长具有一定的滞后性。

2.2 传统平板培养与形态学分析

平板培养法在储藏稻谷的真菌的数量监测和种类分析中使用较为广泛，常使用的培养基包括孟加拉红培养基、马铃薯-葡糖糖-琼脂培养基(PDA培养基)和高盐察氏培养基等。前两种培养基在进行稻谷危害真菌计数时需添加氯霉素抑制细菌生长，但高盐察氏培养基利用高渗环境抑制非真菌生长，三种培养基均可对霉菌和酵母计数，但PDA培养基也可用对纯化霉菌的菌落和镜检形态学鉴定。目前，仍有科研人员研究培养基的配方及使用方法对霉菌监测准确性的影响。梁美丹等[31]发现孟加拉红培养基和PDA培养基对霉菌、酵母菌计数结果差异不明显，霉菌、酵母菌采用正置培养方式检出率比倒置培养方式高。邵敏等[32]向孟加拉红培养基中添加2.0%葡萄糖、0.15%吐温20和0.25%磷酸二氢钾进行改良，发现该改良培养基对常见食品中霉菌的检出率较国标法孟加拉红培养基平均高出59.6%。通过传统平板培养法对霉菌进行计数及分离、鉴定属于微生物分析中的经典方法，但该法耗时长(超过一周)，在稻谷霉变监测中往往无法提供及时的微生物数据，不能给突发状况提供参考。

2.3 孢子计数法

为克服平板培养在稻谷霉菌监测中耗时过长的问题，程树峰等[33]构建了适合于储藏稻谷的危害真菌孢子计数法：稻谷样品采用水提取后，通过滤网除去菌丝体，通过血球计数板计数；该法标准误差范围在12.2%～36.5%，并与平板计数法具有较好的相关性。唐芳等[34]采用真菌孢子计数法研究了水分和温度与储藏稻谷中真菌生长之间的关系，构建了真菌危害早期生长曲线，可预测高水分稻谷短期安全储藏时限。姜洪等[35]对山东省3栋典型稻谷仓中真菌孢子的数量进行了跟踪监测，发现三栋仓中均出现了霉菌孢子数接近或超过106的情况。

2.4 CO2浓度监测法

霉菌生长会产生CO2，造成霉变点CO2浓度升高。唐芳等[36]发现，储藏稻谷中危害真菌数与CO2浓度具有良好的相关性，模拟储藏温度25 ℃和30 ℃下稻谷样品真菌孢子数与CO2相关系数(R2)分别为0.959 1和0.943 9，实仓中粮堆和仓内环境下两者的相关系数分别为0.998 4和0.988 7。唐芳等[37]研发出基于CO2的一种新型的储粮生物危害早期检测仪器，稻谷中CO2浓度与真菌数的相关系数达0.983 8。姜洪等[35]发现，稻谷仓中CO2浓度在熏蒸和通风换气后下降，但真菌孢子一旦产生就一直会被检出，因而研究团队认为真菌孢子技术与粮堆CO2浓度之间的关系具有不确定性。目前，该法仍在技术理论积累阶段，有待实际仓储的推广应用。

2.5 光谱技术

光谱技术具有操作方便、检测速度快的特点，在粮食的成分分析中已有大量应用。近些年，有研究人员尝试利用光谱技术对稻谷中的霉菌进行带菌量分析及菌种鉴别。金昌福等[38]对储藏稻谷近红外光谱中12个波数的特征吸收值与表面霉菌总数进行了关联。所构建的多元线性回归模型相关性较好，R2值达0.943。Sirisomboon等[39]研究了近红外光谱与总真菌、黄绿色曲霉的模型，对90份自然霉菌污染及16份人为霉菌污染的稻谷样品的光谱进行相关分析，发现总霉菌量与原始光谱的相关系数r达0.668，黄绿色曲霉与最大归一化光谱有一定的相关性(r=0.437)。Cong等[40]建立稻谷霉菌监测的高光谱无损监测方法，通过关联光谱数据与霉菌量构建支持向量回归模型，并通过灰狼优化算法对模型优化，发现模型对校正集和预测集拟合的相关系数分别为0.962 1和0.951 1。刘凌平等[41]利用傅里叶变换衰减全反射红外光谱技术对稻谷中尖孢镰刀菌(Pr、Po和M23)、黄灰青霉Pe、扩展青霉3.789 8、灰绿曲霉3.397 5和亮白曲霉7种常见有害霉菌进行快速鉴定方法研究，发现通过主成分分析法可有效区分7种菌株，建立的线性判别分析和偏最小二乘判别分析模型对7种菌株的留一交互验证整体正确率可达87.1%和87.3%。肖慧等[42]利用高光谱图像技术对储藏稻谷中5种真菌(黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、桔青霉)进行区分，对马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养真菌平板的高光谱图像分析发现，谱图波峰709 nm处光谱值拟合的生长模型(R2介于0.909 5～0.967 9)优于全波段光谱值主成分分析中第一主成分得分构建的生长模型(R2介于0.178 1～0.950 1)；主成分分析结合偏最小二乘法判别分析区分5种不同菌种效果良好，最小二乘法判别分析模型对杂色曲霉测试集区分准确率为33.33%外，对其他真菌及对照组的训练集与测试集区分准确率均达100%。尽管光谱技术在稻谷霉菌快速检测中表现出了相当的优势，但欲在实际监测中应用仍需大量系统的研究。

2.6 其他方法

宋伟等[43]利用电子鼻对储藏稻谷挥发性物质的敏感识别能力，在优化传感器阵列后，通过数据训练建立菌落与检测器响应的最小二乘模型，数据验证中发现该法具有一定可行性，但准确度不稳定，仍需进一步完善。

3 储藏稻谷中真菌的防控方法

3.1 温湿度控制

针对真菌对温湿度敏感的特点，仓储实践中通过控制粮食储藏水分、降低粮堆温度等方式抑制真菌生长。田国军等[44]发现，冬季通风降低稻谷水分和温度后，霉菌含量降至入仓时的一半。高树成等[45]在辽宁利用冬季自然低温结合制冷设备6～10月降温控制稻谷温度，发现粮堆夏季温度可控制在21 ℃以下，稻谷表面霉菌数量无明显变化。在利用自然环境减少稻谷储藏控温能耗目前是一个热点的研究领域，目前正在研发和推广的技术包括热泵技术、太阳能技术等[46-49]。

3.2 防霉剂处理

除依靠温湿度控制真菌外，采用化学防霉剂可有效抑制霉菌生长。盛强等[50]研究了食品级双乙酸钠与山梨酸钾复配(质量比4∶1)的复合型防霉剂在高水分稻谷中的抑菌效果，通过3种剂量(0.1%、0.2%和0.3%)应用效果的比较，发现防霉剂施加量越大，防霉效果越好，但效果也与稻谷含水率有关。陈丽丽等[51]研究了谷保防霉剂对稻谷霉菌的抑杀效果，发现剂量0.2%的谷保防霉剂对粮食表面霉菌的抑制率可达95.9%，而对内部霉菌抑杀作用不明显，另外白曲霉对谷保防霉剂有较强的耐受能力。

为减少化学防霉剂的潜在危害，植物源活性成分对储藏稻谷中真菌的抑菌及杀灭作用逐渐被科研人员重视。Paranagama等[52]研究了柠檬草精油对稻谷中提取的黄曲霉菌株的作用效果，发现该精油对所试菌株的抑菌和杀菌浓度分别为0.6和1.0 mg/mL，进一步研究发现其中活性成分为柠檬醛a和b，另外该柠檬精油熏蒸对所试菌株孢子形成和菌丝生长的抑制浓度分别为2.8和3.46 mg/mL。Reddy等[53]研究了一些植物提取物对稻谷中黄曲霉的抑菌作用，发现蒲桃提取物在5 g/kg下可以完全抑制黄曲霉的生长，而姜黄、洋葱和圣罗勒等植物的抽提物在相同浓度下抑菌率在65%～78%。Cardiet等[54]比较了丁香精油、丁香油酚、香芹酚、异硫氰酸烯丙酯及甲酸乙酯对Aspergilluswesterdijkiae和禾谷镰刀菌的抑菌作用，发现其中的异硫氰酸烯丙酯具有较好的抑菌和孢子杀灭能力，其对两种微生物的最低抑菌浓度分别为24.2和19.8 μL/L。

3.3 臭氧处理

臭氧是一种强氧化剂，具有广谱杀灭微生物作用。周建新等[55]储前对稻谷进行臭氧处理，发现臭氧对稻谷霉菌具有显著的杀灭作用，处理后的稻谷在储藏初期霉菌含量出现反弹，但随后的变化与温度有关，储藏温度15和20 ℃下霉菌量基本稳定，而储藏温度25、30、35 ℃时霉菌量均表现出下降趋势。Beber-Rodrigues等[56]发现稻谷自然污染的霉菌在臭氧处理后含量下降，主要霉菌种属对臭氧的耐受性由高到低顺序为：支顶孢属>链格孢属>出芽短梗霉>曲霉>青霉。臭氧不稳定，在空气中的半衰期短，应用后无残留，相对安全，其熏蒸技术是稻谷储藏领域正在推广的一种技术。Savi等[57]对镰刀菌属、青霉属及曲霉属的臭氧抑菌结果表明，60 μmol/mol的臭氧浓度可有效抑制真菌的生长，特别是对禾谷镰刀菌和桔曲霉；臭氧可以抑制分生孢子萌发，造成菌丝形貌变化，从而导致菌丝体死亡及活性氧形成。

3.4 射线处理

在微生物领域，射线可以用来破坏微生物的菌体结构，导致菌体死亡。紫外线、红外线、γ射线及微波射线均被证实可用于杀灭储藏稻谷中的有害真菌。万忠民等[58]研究了紫外线辐照控制稻谷霉菌的可行性及影响抑菌效果的因素，Box-Benhnken中心组合实验的响应面实验结果表明，影响因素由高到低为辐照功率、稻谷处理量、辐照时间，优化得到的辐照条件为辐照时间15.39 min、稻谷处理量74.7g/dm2、辐照功率136.30 W。Wang等[59]在新收获稻谷和复水储藏稻谷中接种黄曲霉后，采用红外加热及缓苏处理，发现延长红外处理和缓苏时间均可增强抑菌效果，初始含水量27.0%的新收获稻谷黄曲霉含量下降高达8.3 log，初始含水量19.4%复水稻谷中黄曲霉含量可达7.2 log。Maity等[60]采用60Co γ射线处理稻谷，发现稻谷中真菌量随处理剂量和储藏时间的延长下降，处理剂量2kGy下致死率达50%。Wang等[61]也发现，随60Co γ射线处理剂量的增加，稻谷中检出的四种主要曲霉(白曲霉、灰绿曲霉、黑曲霉和黄曲霉)的检出率逐渐降低。Braghini等[62]采用稻谷中接种互隔交链孢霉的方法研究了60Co γ射线对该霉菌的抑制和杀灭效果，发现5 kGy的剂量可有效抑制菌体生长，完全抑制菌体增长的剂量需达到10 kGy。Fang等[63]采用低剂量微波对稻谷中分离的寄生曲霉进行处理，发现其可以增加菌体细胞膜通透性，增加菌体电解质、Ca2+、蛋白及DNA的渗漏，使菌丝体粗糙、溶胀；通过与传统加热对比发现，低剂量微波主要通过影响Ca2+透过性和DNA降解引起寄生曲霉死亡，而传统加热则主要通过增加电解质渗透性和DNA浓度的方式。

3.5 其他方法

詹耀等[64]研究了超高压在亮白曲霉污染稻谷中的杀菌效果，发现压力和保压时间对稻谷亮白曲霉的杀菌作用影响显著，压力增大至300 MPa时致死效果明显增强，保压时间越长致死作用越好。Li等[65]通过将聚乙烯和高度分散的Ag/TiO2共混制备出一种纳米薄膜，该薄膜相比普通PE袋抑制霉菌生长的效果显著。

4 结论

作为储备粮种，稻谷的储藏安全关系国计民生。稻谷储藏过程中，真菌活动会引起稻谷霉变、结块，甚至带毒。针对此，科研人员在稻谷中真菌的生长特性、监测及防控等方面进行了大量的研究，许多研究成果已经应用于稻谷的储藏实践中，以科学合理地解决储藏稻谷中真菌的潜在危害。还有许多问题需进一步深入研究，如稻谷储藏过程中不同真菌活动的相互影响、真菌与其他微生物之间的相互作用、粮仓环境中湿热分布对真菌活动的影响、储藏稻谷中真菌的快速分析方法、防霉剂的开发与有效施用技术等。对储藏稻谷中真菌的系统研究，可推动粮食储藏真菌的研究向更深入、全面方向发展，具有重要的学术意义，同时可丰富粮食真菌的防控方法库，为粮食行业的健康稳定发展做出贡献。