甜味蛋白Monellin及其基因工程

赵萌，蔡成固，刘波

（齐鲁工业大学（山东省科学院），食品科学与工程学院，济南 250353）

随着人们物质水平的不断提高，对甜味物质的需求量日益剧增，但近年来糖类的过多摄入引起了一系列的健康问题，如龋齿病、高血糖、过度肥胖等。为了满足消费者对甜味物质的需求，现在市场上存在的非糖类甜味剂主要有3类［1］，分别为：（1）人工合成的非营养型甜味剂，如糖精、阿斯巴甜，其不含任何营养成分且过多摄入会破坏人体内氨基酸的代谢平衡［2］；（2）糖醇类甜味剂，如山梨糖醇、木糖醇等，它们由于甜度低、热量低而成为高甜度甜味剂的替代品，但过量食用会导致腹泻［3］；（3）营养性非糖甜味剂，如甜味蛋白thaumatin，monellin，brazzein等，甜味蛋白作为新型甜味剂具有甜度高、热量低、甜味持续时间长、安全无毒、营养价值高、可降解为氨基酸供人体吸收利用等其他甜味剂无法比拟的优势［4］。鉴于其高营养价值和应用价值，自其被发现后就成为食品和药品领域的研究热点。甜味蛋白主要分离于热带植物的果实或种子，目前发现的一共有8种，分别是 miraculin，pentadin，monellin，thaumatin，mabinlin，curculin，brazzein，neoculin。其中miraculin，neoculin具有甜味调节功能，即自身不产甜味但能将酸味觉变为甜味，curculin既能自产甜味又具有甜味调节功能，而其余5种甜味蛋白本身具有甜味。继thaumatin蛋白被美、英、日、德等国批准应用于食品、医药和化妆品领域后，美国食品和药品管理局（FDA）批准 monellin蛋白为“一般公认为安全（GRAS）”的食品添加剂［5］，但其耐受温度低限制了其工业化生产，因此monallin蛋白在提高热稳定性和甜味方面具有极高的研究价值。

1 甜味蛋白monellin的来源及生化特性

天然monellin蛋白分离纯化于西非热带植物Dioscoreophyllumcumminsii的果实中，由 A，B 2条肽链的94个氨基酸组成，A链45个氨基酸，B链50个氨基酸且只有1个半胱氨酸，蛋白分子量为10.7kDa，2条链通过非共价键链接。天然monellin蛋白由5个反向平行的β－折叠和1个含有17个氨基酸残基组成的α－螺旋构成，其β－折叠和α－螺旋呈现十字交叉的空间结构［6］。其甜味是等质量蔗糖的3000左右，在酸性条件下加热至50℃就会丧失甜味活性［7］。

2 影响monellin蛋白稳定性因素

2.1 共价键作用力

蛋白中分子内部作用力是保持蛋白稳定性和生物学活性的关键因素，一般分子间作用力大小顺序为共价键＞离子键＞金属键＞氢键＞范德华力。天然monellin蛋白的2条肽链以分子间疏水作用、氢键和离子键维持蛋白的三级结构［8］。其在高温下不稳定，对pH的稳定性差且易失去甜味。Kim等［9］通过基因改造在A，B链之间插入Gly－Phy 2个氨基酸使得A，B链以共价键形式相连，从而使单链蛋白的稳定性得到了很大提升。由此证明共价键作用力对monellin蛋白稳定起到重要作用。

2.2 非共价键作用力

支撑蛋白三级结构的重要因素有稳定蛋白构象的分子间库仑力、范德华力、氢键作用、带电性质、分子距离以及氨基酸极性［10，11］，这些作用力也主导蛋白执行特定功能，它们在蛋白内分子距离为5内时起主导作用。Olga Szczepankiewicz等［12］通过将不同性质的氨基酸突变组合后发现通过削弱monellin蛋白分子间的非共价作用导致该蛋白集聚趋势增加，其热稳定性也出现相对的减弱。另外，他们通过定点突变方法改变5内的氨基酸，将不同带电性质的氨基酸替换肽链中关键氨基酸位点后，通过荧光实验和投射电镜发现突变后的蛋白出现了不同程度的聚沉现象。

静电作用力也是影响蛋白稳定的重要因素，其影响程度会随着蛋白外部环境的变化而变化，不同的pH 环 境 对 蛋 白 稳 定 性 有 一 定 的 影 响［13，14］。Nilesh等［15］通过monellin蛋白折叠实验将野生型和位于疏水区域的突变型蛋白E23A在不同pH环境中用不同浓度的盐酸胍溶液处理后，蛋白在展开和重新重叠过程中出现了较大差异。

3 影响monellin蛋白甜味活性因素

3.1 关键氨基酸残基

Catherine研究组将monellin蛋白中G16，V37定点突变为G16A和V37A后甜味明显降低，而甜味降低最明显的G16A并非最不稳定的突变体，说明monellin蛋白的甜度和稳定性之间不存在协同关系。分析表明这2个位点与蛋白C末端聚脯氨酸螺旋的弹性有关，因此C末端聚脯氨酸螺旋的弹性可能参与了甜味蛋白分子与甜味受体的相互作用与激活［16］。Yoon－Hui Sung等发现在monellin蛋白中存在着影响其甜度的关键区域即第一个β－转角的 E2－I5区域［17］。此外，C41位点位于疏水性较强的β－折叠和α－螺旋之间，是monellin蛋白序列中唯一的半胱氨酸，与蛋白中二硫键能形成相互作用力，是维持蛋白活性、影响蛋白甜度的重要位点［18］。

3.2 蛋白表面电荷

Monellin蛋白表面正电荷是影响其甜度的重要因素。Xue Wei－feng等认为增强蛋白表面正电荷即减少蛋白表面负电荷会提高蛋白甜度。然而，增加monellin蛋白表面正电荷改变蛋白甜度也并非完全正确，Esposito等人根据可增加蛋白表面正电荷的氨基酸位点设计了突变体 M42R，Y63R，Y65R和Y68R，其中只有Y65R相对野生型甜度增加［19］。虽然单因素在甜味蛋白与甜味受体T1R2－T1R3多点攻击现象中一般不会使其性质改变，但该研究中的突变体Y65R甜味提高的同时也表现出良好的酸碱及温度耐受［20］。

4 Monellin蛋白的基因工程进展

通过基因改造的以共价键连接的单链monellin基因在工程菌中进行表达，具备原有甜味的同时耐受温度达到60℃，且经高温处理后在弱酸环境中可以恢复甜味活性。目前，单链monellin基因已经成功在微生物和植物中进行异源表达。

4.1 Monellin蛋白的胞内表达

4.2 Monellin蛋白的胞外表达

为了实现monellin蛋白的工业化生产，研究者们致力于基因工程菌的胞外表达。李敏等人将单链monellin基因克隆到大肠杆菌－酵母菌穿梭质粒pPICK9中，在发酵培养基中得到的目的蛋白具有浓郁甜味，通过30L发酵罐发酵培养的蛋白量能达到2.0g/L。金筱耘等［25］将单链monellin基因与绿色荧光蛋白EGFP基因链接，在酵母菌中成功表达的融合蛋白在80℃时仍未变性，在环境pH 3～12之间时，甜度大致为蔗糖的500倍。陈忠军等人将酿酒酵母中的分泌信号肽α－factor基因插入到monellin基因表达质粒中，在酿酒酵母中成功表达出有甜味活性的目的蛋白，他们还在枯草芽孢杆菌中成功表达了分泌性质粒［26，27］。然而并非所有的胞外分泌表达的monellin蛋白都有甜味活性，于学红和刘军等人虽分别在毕赤酵母和酿酒酵母中将其成功表达，却均未检测到甜味［28，29］。

5 研究意义及前景

近年来许多流行病的增加都与糖的摄入有关，随着人们生活水平的提高，对健康食品的需求日益增加。而甜味蛋白由于其安全健康、高甜度及高营养、可吸收的独特优点，极可能成为食品和饮料行业中人工甜味剂的替代品。其中作为甜度很高的monellin虽被美国食品和药品管理局批准为“一般公认安全”的食品添加剂，但因其热稳定性差和生产成本高等原因限制了其大规模市场化。目前对monellin蛋白的研究主要处于实验室阶段，旨在通过对其二级结构与空间结构的解析以及对甜味受体T1R2－T1R3与甜味物质作用机理的研究，利用基因工程技术如常用的定点突变等方式提高monellin蛋白的稳定性和甜味活性以及开发新的表达体系以寻求产量上的突破。重组的甜味蛋白monellin在原核表达系统、真核表达系统以及植物中的成功表达均为其市场化生产奠定了基础。目前monellin蛋白在胞内表达研究集中于提高其产量，寻找更便捷的纯化提取方法，而其在胞外表达因具有高效、纯度高等优点吸引了越来越多的研究者。

甜味蛋白monellin在食品、医药及化妆品市场中进行规模化应用目前还未能实现。主要原因有：（1）天然monellin蛋白来源于热带植物，而重组甜味蛋白仍处于研究阶段，生产成本高，因此在产量和价格上与市场上的人工合成甜味剂相比存有较大差距；（2）monellin蛋白虽然甜度高，但其热稳定性低等生化因素限制其在食品工业中的应用；（3）利用基因工程技术生产出的重组蛋白的安全性需经过严格的生物学活性检验。另外，甜味物质与甜味受体T1R2－T1R3的作用机理未完全明确，因此对甜味蛋白的甜度活性测定还未有一个系统的评判标准。

甜味蛋白其健康、安全的独特优点适用于各类人群，且可在食品、饮料、医药、化妆品等行业广泛应用。随着大众对健康食品的需求日益剧增，生物技术的不断进步，以及研究人员对其机理的深入研究，甜味蛋白在食品等相关工业中会有更大的发展前景，发挥更多的作用。