探讨HBV—DNA定量检测核酸提取过程中的影响因素分析

崔红艳

[摘要] 目的 探讨HBV-DNA（乙肝病毒的脱氧核糖核酸）定量检测核酸提取过程中的影响因素。方法 方便选取2018年1—4月内蒙古赤峰市中心血站经ELISA检测两次的75份合格血液样本为研究对象，分别统计不同浓缩液剂量、不同沉淀摇匀方式和不同裂解煮沸时间的Ig HBV-DNA测定结果，并对各项结果进行统计学分析。 结果 不同浓缩液组别的测定结果与标准方式相比，差异无统计学意义（t=0.140、0.036、0.069、1.088，P>0.05）；B1（4.123±0.187）和B4（4.235±0.160）与标准方式（4.178±0.175）相比，差异有统计学意义（t=2.437、2.082，P<0.05），B2（4.136±0.189）、B3（4.201±0.162）与标准方式相比，差异无统计学意义（t=1.412、0.835，P>0.05）；C1（4.134±0.160）与标准方式（4.203±0.155）对比，明显偏低，差异有统计学意义（t=2.682，P<0.05），C2（4.195±0.138）、C3（4.232±0.167）和C4（4.221±0.169）与标准方式对比，差异无统计学意义（t=0.334、1.102、0.679，P>0.05）。 结论 一定范围内适当改变浓缩剂量、沉淀摇匀方式和裂解煮沸时间并不会对检测结果造成较大影响，但经过预热处理后，振荡摇匀会促使核酸释放和沉淀混匀，临床上要注意相关因素的影响，以提高检测结果的准确性。

[关键词] HBV-DNA；定量检测；核酸提取；影响因素

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）10（c）-0029-03

[Abstract] Objective To investigate the influencing factors of nucleic acid extraction in HBV-DNA （deoxyribonucleic acid）. Methods From January to April 2018， 75 qualified blood samples were tested by ELISA in the blood bank of Chifeng City Center in Inner Mongolia. The doses of different concentrates， different sedimentation methods and different pyrolysis time were counted of Ig HBV-DNA assay results， and statistical analysis of the results was implemented. Results The results of different concentrate groups were not significantly different from the standard methods （t=0.140， 0.036， 0.069， 1.888， P>0.05）； B1 （4.123±0.187） and B4 （4.235±0.160） Compared with the standard method （4.178±0.175）， the difference was statistically significant （t=2.437， 2.082， P<0.05）， B2 （4.136±0.189）， B3 （4.201±0.162） compared with the standard method， the difference was not statistically significant（t=1.412， 0.835， P>0.05）； C1 （4.134±0.160） was significantly lower than the standard method（4.203±0.155）， the difference was statistically significant （t=2.682， P<0.05）， C2（4.195±0.138）， C3 （4.232±0.167） and C4（4.221±0.169） were compared with the standard method， the difference was not statistically significant（t=0.334， 1.102， 0.679， P>0.05）. Conclusion Appropriate changes in concentration dose， sedimentation and pulverization boiling time within a certain range will not have a great impact on the test results， but after pre-heat treatment， shaking will promote the release of nucleic acid and precipitation， clinically pay attention to the influence of relevant factors to improve the accuracy of the test results.

[Key words] HBV-DNA； Quantitative detection； Nucleic acid extraction； Influencing factors

慢性乙型肝炎是臨床上发病率较高的一类疾病，主要是指受检者的乙肝病毒检测结果呈阳性，HBsAg阳性率在10%以下。荧光定量PCR技术融合了PCR技术、杂交技术和光谱技术，通过采集和分析荧光，达到对原始模板进行定量的目的[1-3]。核酸DNA模板的提取过程是关系到定量结果的关键性环节，尤其是对于病毒水平偏低的样本，产生的影响会更加突出。该研究以2018年1—4月中心血站经ELISA检测两次的75份合格血液样本为研究对象，旨在分析HBV-DNA定量检测核酸提取过程中的影响因素，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究方便中心血站经ELISA检测两次的75份合格血液样本为研究对象，其中，检出HBV真阳性25例，其中包括男性15例，女性10例；年龄最大52岁，年龄最小21岁，平均年龄为（38.86±2.31）岁。非活动性HBsAg携带者20例，其中包括男性11例，女性9例；年龄最大51岁，年龄最小20岁，平均年龄为（38.75±2.46）岁。轻度慢性乙型肝炎受检者30例，其中包括男性18例，女性12例；年龄最大50岁，年龄最小20岁，平均年龄为（38.96±2.54）岁。所有入选病例均经医院伦理委员会批准，且患者和家属知情同意。

1.2 研究方法

浓缩液：标准组的浓缩液剂量为100 μL，A1的浓缩液剂量为90 μL，A2的浓缩液剂量为95 μL，A3的浓缩液剂量为105 μL，A4的浓缩液剂量为110 μL。五组除浓缩液剂量不同外，其余操作方式均按照说明书的要求进行操作。

沉淀摇匀方式：标准组的沉淀摇匀方式为直接敲打混匀15 s，B1的沉淀摇匀方式为漩涡振荡仪振荡15 s，B2组沉淀摇匀方式为漩涡振荡仪振荡30 s，B3沉淀摇匀方式为56℃预热120 s再漩涡振荡15 s，B4沉淀摇匀方式为56℃预热180 s再漩涡振荡15 s。五组除沉淀摇匀方式不同外，其余操作方式均按照说明书的要求进行操作。

裂解煮沸时间：标准组的裂解煮沸时间为10 min，C1的裂解煮沸时间为6 min，C2的裂解煮沸时间为8 min，C3的裂解煮沸时间为12 min，C4的裂解煮沸时间为14 min。5组除裂解煮沸时间不同外，其余操作方式均按照说明书的要求进行操作。

1.3 观察指标

①对不同剂量浓缩液与标准浓缩液的测定结果进行统计，并对各组数据进行统计学处理。

②对不同摇匀方式与标准方式的测定结果进行统计，并对各组数据进行统计学处理。

③对不同裂解时间与标准方式的测定结果进行统计，并对各组数据进行统计学处理。

1.4 统计方法

该研究中的所有数据均纳入SPSS 16.0统计学软件中，计数资料用[n（%）]表示，行χ2检验；计量资料用平均数±标准差（x±s）的形式表示，行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准方式与不同剂量浓缩液的测定结果对比分析

不同浓缩液组别的测定结果与标准方式相比，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 标准方式与不同摇匀方式的测定结果对比分析

B1（漩涡振荡仪振荡15 s）和B4（56℃预热180 s再漩涡振荡15 s）与标准方式相比，差异有统计学意义（P<0.05），B2、B3与标准方式相比，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3 标准方式与不同裂解时间的测定结果对比分析

C1（裂解煮沸时间为6 min）与标准方式对比，明显偏低，差异有统计学意义（P<0.05），C2、C3和C4与标准方式对比，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

3 讨论

实时荧光定量PCR技术可以反映出患者体内的HBV感染情况，同时也可以评估治疗后的恢复情况，为临床诊疗提供指导。采用此种方法进行检测，不需要进行PCR后处理，可有效的避免发生交叉感染，提高了定量的准确性，是目前用于乙肝和其他传染病的主要技术[4-6]。但PCR的检测结果仍然会受到一些因素的影响，导致检测结果不准确。该研究对较为常见的3种影响因素进行进一步的分析和探讨，在坚持方便操作、结果准确的原则基础上，对浓缩剂量、沉淀混匀方式和煮沸裂解时间等提取核酸的关键性影响因素进行研究，现进行具体分析。

首先，分析浓缩液剂量对检测结果的影响。浓缩液本身的粘稠度相对较高，如果在检测过程中出现加样枪使用不规范或不标准的情况，这则会导致在加入检测管的过程中出现加入量过多或加入量不足的情况。上述情况往往会出现在刚刚进入临床实习的学生或是刚进入临床工作的相关人员身上，一些工作经验丰富的工作人员出现此类错误的可能性是非常小的。因此，上述结果可能会产生的影响并不是很明确，该研究在其他条件都不改变的情况下，改变浓缩液的剂量，再进行测试。经研究发现，结果显示，浓缩液剂量上，不同浓缩液组别的测定结果与标准方式相比无显著差异，这说明在确保严格执行说明书操作规范的情况下，对浓缩液剂量进行适当增减，并不会影响最终的测定结果。

其次，分析沉淀摇匀方式对检测结果的影响。虽然采用敲打混匀的方式，可以让沉淀彻底溶解，但此种方法会导致EP管破裂造成污染，而不同操作人员的敲打时间和敲打力度都是存在一定差异的，这对于操作的规范化是非常不利的。采用高速漩涡振荡仪则可以很好的弥补这一缺陷，并且可以对敲打时间和敲打力度进行有效控制，检测出管底部受力是否均匀。在该组研究结果中，B1（4.123±0.187）和B4（4.235±0.160）与标准方式（4.178±0.175）相比，差异有统计学意义，B2（4.136±0.189）、B3（4.201±0.162）与标准方式相比，差异无统计学意义，这说明其余两种方式可成为替代操作方式，对核酸的释放可起到有利作用，沉淀溶解可以更加完全[7-8]。

最后，分析煮沸时间对检测结果的影响。在工作中，往往会因为多种因素影响煮沸时间，煮沸时间不够或者是煮沸时间相对较长，则会导致结果的准确性受到不同程度的影响。C1（4.134±0.160）与标准方式（4.203±0.155）对比，明显偏低，C2（4.195±0.138）、C3（4.232±0.167）和C4（4.221±0.169）与标准方式对比差异无统计学意义。这说明煮沸时间不够，病毒难以完全释放，会导致检测结果偏低。这与黎茵[9]报道中的结果相似，黎茵报道中提出，标准组与旋涡混匀15 s组（4.125±0.186）以及56℃预热180 s（4.199±0.164）后在旋涡沉淀混匀15 s组之间存在较大差异，裂解煮沸时间6min组（4.195±0.138）和裂解煮沸时间10 min组（4.222±0.168）之间的差异较大，差异有统计学意义（P<0.05）。

综上所述，一定范围内适当改变浓缩剂量、沉淀摇匀方式和裂解煮沸时间并不会对检测结果造成较大影响，但经过预热处理后，振荡摇匀会促使核酸释放和沉淀摇匀。

[参考文献]

[1] 赵皖秋，任文娟，李伟，等.HBV感染者胚胎中HBVDNA的測定及其相关因素分析[J].生殖医学杂志，2016，25（1）：39-43.

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[5] 郑志远.超敏和普敏两种方法在血清HBV-DNA定量检测中的比较研究[J].中国现代药物应用，2017，11（12）：10-12.

[6] 张明哲，杨智敏，刁英，等.父母单一感染患者辅助胚胎HBVDNA检测对乙型肝炎病毒感染的诊断价值研究[J].中华医院感染学杂志，2017，27（21）：4982-4985.

[7] 张敬，罗宝昌.抗凝状态不同的血液标本对实时荧光定量PCR法测定HBV-DNA结果的差异性研究[J].河北医学，2017，23（12）：2058-2061.

[8] 姚懿雯，李冬.Autrax全自动核酸提取工作站对高敏HBVDNA检测的性能评价[J].国际检验医学杂志，2017，17（23）：3237-3239.

[9] 黎茵.HBV-DNA定量检测核酸提取过程中影响因素的研究[J].中国保健营养，2016，26（33）：408，409.

（收稿日期：2018-07-28）