COX—2活化PI3K/Akt信号通路促结直肠癌肝转移的实验研究

闫康鹏　江长安　吴昆

【摘要】 目的：探討COX-2促进结直肠癌肝转移效果及其机制，从而为结直肠癌肝转移防治提供依据。方法：建立COX-2低表达和高表达CT26结肠癌细胞株，通过注射0.2 mL的对数生长期细胞浓度为1×106 个/mL的正常CT26结肠癌细胞悬液（A组，n=20）、COX-2高表达的CT26结肠癌细胞悬液（B组，n=20）以及COX-2低表达的结肠癌细胞悬液（C组，n=20）至脾脏制作小鼠结肠癌肝转移模型，检测比较三组小鼠移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt表达、移植瘤体积、肝脏肿瘤大小和数量以及生存期，并分析结直肠癌肝转移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表达的相互关系以及三者与其移植瘤体积、肝脏肿瘤大小和数量以及生存期的关系。结果：与A组比较，B组和C组移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白检测阳性率均升高，移植瘤体积降低，肝脏肿瘤大小和数量降低，生存期延长（P<0.05）。与B组比较，C组移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白检测阳性率均升高，移植瘤体积降低，肝脏肿瘤大小和数量降低，生存期延长（P<0.05）。Spearman相关分析结果显示，结直肠癌肝转移小鼠移植瘤COX-2蛋白表达与其PI3K、p-Akt蛋白表达呈正相关（P<0.05），且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt与其移植瘤体积、肝脏肿瘤大小和数量均呈正相关（P<0.05），与其生存期均呈负相关（P<0.05）。结论：COX-2可促结直肠癌肝转移和影响其预后，在此过程中可能涉及其活化PI3K/Akt信号通路作用。

【关键词】 COX-2； 活化； PI3K； Akt； 信号通路； 结直肠癌； 肝转移

Experimental Study on COX-2 Promoting Liver Metastasis of Rectal Cancer by Activating PI3K/Akt Signaling Pathway/YAN Kangpeng，JIANG Changan，WU Kun.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：001-005

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of COX-2 on the liver metastasis of colorectal cancer and its mechanism，so as to provide the basis for prevention and treatment of liver metastasis of colorectal cancer.Method：COX-2 low expression and high expression CT26 colon cancer cell line were established，and mouse colon cancer liver metastasis model was established by injecting 0.2 mL of 1×106/mL cell concentration logarithmic growth phase normal CT26 colon cancer cell suspension（group A，n=20），COX-2 high expression colorectal cancer cell suspension（group B，n=20） and COX-2 low expression colorectal cancer cell suspension（group C，n=20） into spleen.The expression of COX-2，PI3K，p-Akt，the volume of transplanted tumor，the size and number of liver tumor and the survival time of three groups were analyzed and compared.The relationship between COX-2 expression with PI3K，p-Akt expression，the volume of transplanted tumor，the size and number of liver tumors and the survival time were analyzed.Result：Compared with group A，COX-2，PI3K and p-Akt positive protein expression rate of group B and group C were increased，the volume of transplanted tumor of group B and group C were decreased，the size and number of liver tumor of group B and group C were decreased，and the survival time of group B and group C were prolonged（P<0.05）.Compared with group B，COX-2，PI3K and p-Akt positive protein expression rate of group C were increased，the volume of transplanted tumor of group C were decreased，the size and number of liver tumor of group C were decreased，and the survival time of group C was prolonged（P<0.05）.Spearman correlation analysis showed that COX-2 protein expression was positively correlated with PI3K and p-Akt protein expression in colorectal cancer liver transplanted mice（P<0.05）.The expression of COX-2，PI3K and p-Akt were positively correlated with the tumor volume， the size and number of liver tumors（P<0.05），and negatively correlated with the survival time（P<0.05）.Conclusion：COX-2 can promote the liver metastasis of colorectal cancer and affect its prognosis.In this process，it may be involved in the activation of PI3K/Akt signaling pathway.endprint

【Key words】 COX-2； Activation； PI3K； Akt； Signaling pathway； Colorectal cancer； Liver metastasis

First-authors address：Jiangxi Provincial Cancer Hospital，Nanchang 330029，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.001

结直肠癌为临床常见恶性肿瘤，常可发生肝脏转移而加重其治疗困难程度，影响预后[1-2]，因此，对结直肠癌肝转移进行有效的防治具有重要性和紧迫性。结直肠癌等癌症的发生发展涉及多个机制，其中环氧酶-2（COX-2）、PI3K-Akt信号通路等均为癌症密切相关基因[3-4]。然而目前关于COX-2、

PI3K-Akt信号通路在结直肠癌肝转移中的作用及其相互关系研究甚少。因此，本研究制作了不同COX-2表达情况的小鼠结肠癌肝转移模型，检测比较了其PI3K-Akt信号通路表达、病情和预后等情况，并分析了其相互关系，旨在为结直肠癌肝转移的防治提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 小鼠结肠腺癌CT26细胞株均购自上海麦莎生物有限公司。小鼠为SPF级的BALB/C小鼠，均为雄性，年龄6～8周，中位年龄48 d，体重15～23 g，中位体重19 g，均购自复旦大学实验动物部，独立饲养，自由摄食摄水。

1.2 实验方法

1.2.1 主要仪器和试剂 恒温箱（江苏佳美仪器有限公司），胰蛋白酶（美国Sigma 公司），玻璃瓶、吸管、试管、注射器等（广东东普医疗科技有限公司），RPMI-1640培养基和胎牛血清（美国Gibco公司），显微镜（日本Nikon公司），COX-2 RNA干扰靶序列（苏州泓迅生物科技股份有限公司），真核表达载体（上海捷兰生物技术有限公司），RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），实时定量PCR试剂盒和SYBR Premix EX Taq（日本Takara公司），单克隆鼠抗人COX-2试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），单克隆鼠抗人PI3K试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），单克隆鼠抗人p-Akt试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），COX-2二抗试剂盒（美国Sigma公司），PI3K二抗试剂盒（美国Sigma公司），p-Akt二抗试剂盒（美国Sigma公司）。

1.2.2 建立COX-2低表达和高表达CT26结肠癌细胞株 建立COX-2低表达CT26结肠癌细胞株：设计靶向COX-2基因RNA干扰序列，并利用真核表达载体构建重组质粒，瞬时转染CT26结肠癌细胞筛选阳性克隆，经传代10次以上，RT-PCR检查确定结肠癌细胞株COX-2表达，建立COX-2低表达结肠癌细胞株（≤COX-2正常表达的50%）。

建立COX-2高表达CT26结肠癌细胞株：克隆野生型COX-2全长基因，构建COX-2真核细胞表达质粒，转导入CT26结直肠癌细胞株，筛选阳性克隆，经传代10次以上，RT-PCR检查确定结肠癌细胞株COX-2表达，建立高表达结肠癌细胞株（≥COX-2正常表达的200%）。

1.2.3 小鼠结肠癌肝转移模型的建立 取对数生长期COX-2低表达、正常表达和高表达CT26结肠癌细胞，添加胰消化酶消化后采用RPMI-1640制成细胞悬液，细胞浓度调节为1×106个/mL。小鼠腹部皮肤酒精消毒后通过注射器将0.2 mL的对数生长期细胞浓度为1×106个/mL的正常CT26结肠癌细胞悬液（A组，n=20）、COX-2高表达的CT26结肠癌细胞悬液（B组，n=20）以及COX-2低表达的结肠癌细胞悬液（C组，n=20）注射至小鼠脾脏上缘，制作小鼠结肠癌肝转移模型。

1.2.4 相关指标检测观察 小鼠结肠癌肝转移模型制备后每3天进行一次小鼠体重检查、超声移植瘤体积、肝脏肿瘤大小和数量检查等，以末次检查结果为最终结果，并观察其自然生存期。三组小鼠死亡后均剖腹切取移植瘤进行COX-2、PI3K、p-Akt表达的检测，将获得的标本常规制成石蜡包块，切成4 μm厚连续石蜡切片，检测前常规行二甲苯脫蜡、梯度酒精水化后高压抗原修复3次，3%过氧化氢灭活内源性生物素和过氧化物酶后添加正常山羊血清封闭孵育，添加即用型COX-2、PI3K、p-Akt单克隆抗体后孵育过夜，添加COX-2、PI3K、p-Akt二抗后室温孵育，行DAB显色，显色满意后行苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片观察，显微镜下随机选取5个视野进行观察，以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达，统计各基因阳性表达情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件包，计数资料比较采用 字2检验，多组计量资料比较采用方差分析，进一步两两比较采用q检验，采用Spearman相关分析法分析结直肠癌肝转移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表达的相互关系以及三者与其移植瘤体积肝脏肿瘤大小和数量以及生存期的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白检测阳性率比较 与A组比较，B组和C组移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白检测阳性率均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与B组比较，C组移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白检测阳性率均升高，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1和图1～3。

2.2 三组病情和预后比较 与A组比较，B组和C组移植瘤体积降低，肝脏肿瘤大小和数量降低，生存期延长，差异均有统计学意义（P<0.05）。与B组比较，C组移植瘤体积降低，肝脏肿瘤大小和数量降低，生存期延长，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。endprint

2.3 结直肠癌肝转移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表达的相互关系以及三者与其移植瘤体积、肝脏肿瘤大小和数量以及生存期的关系分析 Spearman相关分析结果显示，结直肠癌肝转移小鼠移植瘤COX-2蛋白表达与其PI3K、p-Akt蛋白表达呈正相关（r=0.892、0.883，P<0.05），且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt与其移植瘤体积、肝脏肿瘤大小和数量均呈正相关（COX-2：r=0.879、0.825、0.878，PI3K：r=0.821、0.848、0.828，p-Akt：r=0.808、0.852、0.816，P<0.05），与其生存期均呈负相关（r=-0.835、-0.812、-0.827，P<0.05）。

3 讨论

近年来随着生活水平的提高，饮食结构发生了明显的改变，各类消化系统疾病的发生亦不断增加。结直肠癌是临床常见消化系统恶性病变，可发生于结直肠的任意部位，近年来其发病不断增加，已成为严重困扰人类健康和威胁患者生命安全的重要病症[5-7]。且结直肠癌可发生远处转移，在其远处转移中肝转移是最为常见转移脏器，其肝转移的发生可进一步加重病情和治疗困难程度，严重威胁患者健康和生存[8-10]。本研究结直肠癌小鼠模型均可进一步出现肝脏转移，且其肝脏转移瘤书库较多，体积较大，可影响病情和疗效，甚至影响生存期。因此，结直肠癌肝脏转移发生率，对病情和预后影响大，明确其发生发展机制对结肠癌肝转移的防治均具有重要的指导意义。

结直肠癌等癌症的发生发展涉及多个机制，而其肝转移等远处转移的发生确切机制不明。已有研究证实，结直肠癌肝转移的发生涉及多个癌症相关基因表达异常[11-12]。在癌症相关基因中，COX-2是常见的促癌基因，而选择性地进行COX-2表达抑制有利于促进癌细胞增殖、侵袭和转移[13-14]。因此，COX-2亦可能促进结直肠癌细胞迁移，导致肝转移等远处转移的发生。PI3K-Akt信号通路在人类大多数恶性肿瘤发生发展中均具有重要作用，可通过促进癌症细胞的增殖和存活并抑制癌症细胞的凋亡而促进癌症发生发展[15-16]。亦有多个研究证实了PI3K-Akt信号通路在肿瘤细胞转移中具有重要作用[17-18]。因此，PI3K-Akt信号通路激活可能为结肠癌肝转移的重要机制，而COX-2则可能协同或调控PI3K-Akt信号通路从而影响结肠癌肝转移，然而目前此方面研究甚少，需进一步研究证实[19-20]。

本研究制作了COX-2低表达、COX-2正常表达和COX-2高表达结直肠癌肝转移动物模型，并对其PI3K-Akt信号通路情况进行了分析，结果显示，COX-2表达率较高组的结直肠癌肝转移动物中PI3K-Akt信号通路表达亦越高，提示COX-2表达可能与PI3K-Akt信号通路相关。而进一步的Spearman相关分析结果显示，结直肠癌肝转移小鼠移植瘤COX-2蛋白表达与其PI3K、p-Akt蛋白表达呈正相关，且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt与其移植瘤体积、肝脏肿瘤大小和数量均呈正相关，与其生存期均呈负相关。结直肠癌肝转移中COX-2、PI3K-Akt信号通路均具有促进作用，而PI3K-Akt信号通路的激活情况与COX-2表达情况一致，由此可推论COX-2可能通过PI3K-Akt信号通路的激活而促进结直肠癌肝转移的发生发展，而抑制COX-2和PI3K-Akt信号通路表达可能为结直肠癌肝转移防治的重要途径，此方面尚需更深入研究证实。

综上所述，COX-2可能通过PI3K/Akt信号通路激活促进结直肠癌肝转移和影响预后，COX-2和PI3K-Akt信号通路均可能为结直肠癌肝转移防治的重要靶点。

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（收稿日期：2017-09-15） （本文编辑：程旭然）endprint