基于环介导等温扩增技术快速检测茶白星病菌的方法研究

周凌云，刘红艳，李 维，向 芬，曾 振，王振中

（1.湖南省农业科学院 茶叶研究所，湖南 长沙410125；2.华南农业大学 农学院，广东 广州 510642）

茶白星病（Tea white scab）是全球高海拔茶园最严重的真菌病害之一。生产上通常采用多菌灵等化学农药对该病进行防控，因发病期常为多雨季节，不但防效不佳，杀菌剂的过量使用往往导致茶叶农残超标。茶白星病在日本、韩国等地分别报道其病原为痂囊腔菌E.leucospila（无性阶段为黑盘孢菌Sphaceloma.theae）[1-3]。2000年，Notomi等建立了一种非常实用而又有效的核酸扩增技术——环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP）[4]。LAMP通过针对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增，产生副产物焦磷酸镁形成乳白色沉淀，加入染色剂即可通过颜色变化观察判定结果。本文以痂囊腔菌基因为靶基因，利用LAMP技术扩增靶基因，设计引物，优化反应条件，建立了一个茶白星病菌快速LAMP检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

痂囊腔菌分离自湖南省石门县白云山林场茶园的茶白星病叶，由本实验室分离并保存。

1.2 试 剂

Loopamp®“朗报®”脱氧核糖核酸扩增试剂盒与Loopamp®“朗报®”荧光目视检测试剂盒均购自北京蓝谱生物科技有限公司，真菌DNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 LAMP 法的建立

采用真菌试剂盒抽提痂囊腔菌，将LAMP反应体系（引物、模板DNA、Bst DNA聚合酶、dNTP和缓冲液） 在95℃加热5 min后冷却，再加入 8 U Bst DNA 聚酶，在 60℃保温 60 min，然后在高于80℃的温度下10 min使Bst DNA聚酶失活终止反应。反应液混合后观察离心管中反应液颜色，如发生特异性扩增，直接目视或在紫外灯下观察，溶液均变为绿色，否则保持SYBR Green 橙色不变。

1.3.1 LAMP引物的筛选

参照GenBank中E.leucospila（无性阶段为S.theae）基因序列，应用Clustal W进行多重比对，分析序列的保守区，利用在线设计软件Primer Explorer V 4.0，设计 4 套 LA MP 引物，每套引物均包括2条外引物与2 条内引物，引物由华大基因科技有限公司合成，根据颜色变化及其重复性对引物进行筛选。

1.3.2 LAMP法反应优化

反应温度选取60℃、61℃、62℃、63℃、64℃这5个温度条件进行LAMP反应，实时观察反应颜色。进一步对引物浓度比例、模板浓度和反应时间进行优化。

1.4 LAMP 法结果鉴定

核酸染色法反应结束后，在反应体系中加入荧光染料，于自然光及紫外灯下观察反应结果。

1.4.1 LAMP的敏感性试验

将抽提E.leucospilaDNA模板分别配置成1x10-2～10-54个稀释度，用所建立的LAMP和PCR方法进行灵敏性比对试验。PCR的反应体系：配置成25 μL的反应体系，引物F1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’），R1（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），56℃变性30 s循环35次。

1.4.2 LAMP特异性实验

应用真菌试剂盒抽提痂囊腔菌属和茶炭疽病菌DNA，按照所建立痂囊腔菌LAMP检测方法，进行特异性实验。

2 结果与分析

2.1 引物的筛选

根据S.theae的ITS1序列与E.leucospil的rDNA序列分别设计了4组引物，最后实验明确有效的引物对来自Elsinoe属核糖体DNA的1组特异性引物，分别为外引物1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’）；外引物2：B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’）；内引物 1：FIP（5’-GCCAGAACCAAG AGATC CGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCA GTC-3’）；内引物2：BIP（5’-TGAA GAACGCAGC GAAATGCG-GCGCAATGTGCG TTCAA-3’）。

2.2 反应条件的优化结果

反应体系：反应缓冲液12.5 μL，其中FIP：30 pmol，BIP：30 pmol，F3：10 pmol，B3：10 pmol，BstDNA 聚合酶 1 μL，加去离子水 ddH2O成23 μL。其中反应缓冲液组成：Tris－HCl（pH8.8）：40 mM，KCl：20 mM，MgSO4:16 mM，（NH4）2SO4：20 mM，Tween20：0.2%，Betaine：1.6 M，dNTPs：2.8 mM。

反应条件：63℃反应l h后立即于80℃金属水浴锅10 min使酶灭活。荧光目视检测时，向预混溶液中添加Loopamp®“朗报®”荧光目视检测试剂，以便肉眼观察是否检出E.leucospil。

2.3 特异性实验

利用已建立的LAMP检测方法，以痂囊腔菌与茶炭疽病菌（Gloeosporium theae sinensis Miyake）为模板进行特异性试验。荧光目视与紫外灯检测结果均表明，与阳性对照呈色一致的为痂囊腔菌，茶炭疽病菌呈色与阴性对照相同，初步确定本方法设计的引物对痂囊腔菌具有专一性（图1）。

图1-A 特异性实验的荧光目视检测结果（1为阳性对照，2为痂囊腔菌，3为阴性对照）Fig.1-A specificity of the experimental result of the fluorescence visual detection

图1-B 特异性实验的紫外检测结果（1为阳性对照，2为茶炭疽病，3为阴性对照）Fig.1-B specificity of the experimental results of the ultraviolet detection

2.4 灵敏度实验

利用已建立的LAMP检测方法，以稀释成 10-2、10-3、10-4、10-5的痂囊腔菌 DNA 为模板，以PCR作为对照，结果发现，1-4号管反应液颜色为绿色，LAMP能扩增出10-5痂囊腔菌DNA模板，而PCR的扩增浓度限于10-4痂囊腔菌DNA，从而明确LAMP法在灵敏度上高于PCR10倍（图2）。

图2-A 灵敏度实验的显色法检测结果Fig.2-A sensitivity test results of the color detection method

图2-B 灵敏度实验的电泳法检测结果Fig.2-B Sensitivity test results of electrophoresis detection method

3 结 论

本文通过设计、筛选引物与优化反应建立了痂囊腔菌的LAMP检测方法，为茶树病菌快速检测构建了一个技术平台。植物病害如灰葡萄孢菌、镰刀菌等病菌的鉴定上逐渐采用LAMP方法替代[5-9]。LAMP法较PCR法更加简便快速，从DNA提取、LAMP反应到结果观察只需2 h即可完成，比目前普遍采用的PCR检测方法缩短一倍的时间，而且灵敏度提高10倍，特异性强，仪器要求简单，一个水浴锅即可完成，观察简单易行，加入了荧光染色剂，在日光下即可清晰直观反应结果，具有对低浓度菌致病早期鉴定的价值，适宜实验室与基层田间使用。

但本研究通过LAMP快速检测的痂囊腔菌属，仅限于分离菌抽提DNA为模板，尚需要优化病叶直接抽提DNA，进行LAMP技术需进一步优化以适合于各种现场应用场合。其次，由于LAMP只需少量模板，即可获得大量特异性扩增产物，应避免局域环境被这些产物污染，除了提高操作的速度与严密性，需进一步优化反应材料，加强茶白星病快速检测和鉴定水平。

[1]高屋茂雄,福田德治,大池康子.病斑における茶白星病Elsinoe leucospila の分生孢子形成れ[J].茶技研,1975(49):71-77.

[2]陈宗懋,陈雪芬 .茶树病害的诊断与防治[M].上海 :上海科技出版社,1989.

[3]박서지 .차나무의병해 II.phaceloma theae 에의한차흰별무늬병 .식물병리학회지,1995,11(4): 383-385.

[4]Notomi T,Okayama H,Masubuehi H,et a1.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28 (12): 63.

[5]Duan Y B,Ge C Y,Zhang X K,et a1.Development and evaluation of a novel and rapid detection assay for Botrytis cinerea based on loop-mediated isotheral amplification[J].PLoS ONE,2014(9): el11094.

[6]Liu S M,Duan Y B,Ge C Y,et a1.Functional analysis of the 132-tubulin gee of Fusarium graminearum and the 3-tubulin gene of Botrytis cinerea by homologous replacement[J].Pest Management Science，2013(69): 582-588.

[7]Niessen L,Vogel R F.Detection of Fusarium graminearum DNA using a loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assay[J].International Journa l of Food Microbiology,2010(140): 183-191.

[8]Niu J H,Jia n H,Gun Q x,et a1.Evaluation of loop-mediated isothermal amplification(LAMP) assays based on 5S rDNA.IGS2 regions for detecting Meloidogyne enterolobii[J].Plant Pathology,2012(61): 809-819.

[9]Hara-Kudo Y,Yoshino M,Kojima T,et a1.Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Salmonella[J].FEMS microbiology letters,2005,253(1): 155-161.