IMP3在高龄葡萄胎及侵蚀性葡萄胎孕妇中的表达研究

曹雪霞 张丽娟* 张梅娜 常海丽 杨 敏 赵敏英 董 静 张 娜 宋 洁 刘玉娜 刘 莉 谢祯芳

滋养细胞来源于胚胎的胚外层细胞，早期胎盘的滋养细胞具有许多类似恶性肿瘤的特性，表现为迅速增生并侵蚀子宫内膜。常见的妊娠滋养细胞疾病(gestational trophoblastic diseases，GTD)包括葡萄胎(hydatidiform mole，HM)、侵蚀性葡萄胎(invasive hydatidiform mole，IHM)和绒毛膜癌(choriocarcinoma，CCA)，其病理特征为滋养细胞的异常增生[1]。其中HM是妊娠后胎盘绒毛滋养细胞异常增生间质水肿所形成，良性HM主要局限在宫腔，大多数可经清宫治愈；而IHM多继发于HM之后，具有局部浸润和(或)远处转移的能力，是常见的一种妇科滋养细胞肿瘤。

胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3(insulinlike growth factor ⅡmRNA-binding protein 3，IMP3)是一种癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，是ⅡmRNA结合蛋白家族中的一员[2]。近年来，因其在各种恶性肿瘤的细胞侵袭和粘附中起到重要作用而备受关注。本研究通过分析其在40岁以上HM和IHM患者经联合化疗行子宫切除术术后的表达，了解其在HM恶化进展中的作用和对IHM病情的评估，为其预后判断提供新的方法和依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

(1)选取1990年9月至2010年9月河北医科大学第二医院的103例40岁以上HM患者清宫术后病理存档石蜡组织标本，对病例进行回顾性研究。其中年龄40～56岁；按照检测患者组织标本中血清β-人绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)水平的不同，将其分为观察组(β-hCG＞2×105mIU/ml，67例)和对照组(β-hCG＜2×105mIU/ml，36例)。观察组平均年龄(47.06±0.61)岁；对照组平均年龄(46.78±0.41)岁。

(2)选取88例40岁以上IHM患者经化疗行子宫切除术石蜡包埋组织标本，年龄40～57岁，按照β-hCG水平的不同，将其分为观察2组(β-hCG＞2×105mIU/ml，52例)和对照2组(β-hCG＜2×105mIU/ml，36例)。均为临床Ⅰ期，术前均行双枪化疗，平均(3.55±1.83)个疗程。观察2组平均年龄(46.89±0.50)岁，预后评分≥7分；对照2组平均年龄(46.72±0.54)岁，预后评分≤6分。所有病例为临床明确诊断，由病理证实。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

(1)主要仪器。LEICA RM2135型石蜡切片机(德国Leica公司)；OLYMPUS CX21型光学照相显微镜(日本OLYMPUS公司)；ZPJ-1型展片机(天津天利公司)；隔水式电热恒温培养箱(上海医用恒温设备厂)；XMT-H型数显温控仪(上海沪南科学仪器联营厂)。

(2)主要试剂。兔抗人IMP3多克隆抗体(英国Abcam公司)；免疫组化试剂盒[链霉亲和素-过氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)，北京鼎国生物技术有限公司]；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；氨丙基三乙氧硅烷(3-amino propyltri ethoxy silane，APES)防脱片试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 试验方法

所有蜡块标本以5 μm厚度切片制片，每张切片经苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色、常规病理形态学观察证实后纳入，采用SP法进行染色，与已知阳性对照切片进行阳性对照，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.4 观察与评价指标

(1)观察比较103例40岁以上HM患者IMP3基因在HM中的表达情况；观察比较88例40岁以上IHM患者IMP3基因在IHM中的表达情况。

(2)IMP3基因位于细胞浆，以细胞浆内出现棕黄色或棕褐色的染色定为阳性。参照免疫组织化学反应结果的评定标准，采用显色强度结合阳性细胞百分比法判读结果，细胞浆内出现深棕色颗粒(强阳性)为3分，出现淡黄色颗粒(弱阳性)为1分，介于两者之间(中度阳性)为2分[3]。在高倍镜视野下计算滋养细胞的阳性细胞数的百分率，阳性细胞数分为4级：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。根据显色程度判定阳性程度分为4级：基本不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将染色强度分值与阳性细胞百分率分值相乘之积为每个视野得分，共5个高倍视野，每个视野平均值为最后得分：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性(++)，＞6分为强阳性(+++)。

表2 IMP3在观察2组和对照2组IHM患者中治疗前后的表达

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计分析，组内进行卡方检验，组间用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IMP3基因在HM中的表达

(1)观察组中IMP3阳性表达24例，其中强阳性表达7例，一般阳性表达11例，弱阳性表达6例，IMP3阳性表达率为35.82%(24/67)；恶变为IHM的16例，恶变率为66.67%(16/24)。IMP3阴性表达43例，恶变为IHM的8例，恶变率为18.60%(8/43)。IMP3阳性表达与阴性表达的恶变率比较，其差异有统计学意义(x2=15.477，P＜0.05)。观察组HM的IMP3阳性表达如图1所示。

图1 β-hCG＞2×105 mIU/ml时HM的IMP3阳性表达病理图(×200)

(2)对照组中IMP3的阳性表达3例，其中强阳性表达0例，阳性表达1例，弱阳性表达2例，阳性表达率为8.33%(3/36)；恶变为IHM的3例，恶变率为100%(3/3)；IMP3阴性表达33例，恶变为IHM的7例，恶变率为21.21%(7/33)。IMP3阳性表达与阴性表达的恶变率比较，差异有统计学意义(x2=1.61，P＜0.05)。对照组HM的IMP3阴性表达如图2所示。

(3)观察组IMP3阳性表达率(35.82%)与对照组IMP3阳性表达率(8.33%)比较，其差异有统计学意义(x2=9.148，P＜0.05)，见表1。

图2 β-hCG＜2×105 mIU/ml时HM的IMP3阴性表达病理图(×200)

表1 两组IMP3在HM患者中的阳性表达率比较

2.2 IMP3在IHM中的表达

IMP3蛋白于两组患者IHM滋养细胞的胞浆中均有表达，观察2组化疗前IMP3的阳性表达率为94.23%(49/52)，化疗后IMP3的阳性表达率为82.69%(43/52)。对照2组化疗前IMP3的阳性表达率为77.78%(28/36)，化疗后IMP3的阳性表达率为58.33%(21/36)。两组化疗前和化疗后IMP3的阳性表达率比较差异具有统计学意义(x2=3.868，x2=6.364；P＜0.05)，见表2。

3 讨论

目前，滋养细胞肿瘤临床治疗评估和预后观察主要依据血清β-hCG，随着分子生物学和生物医学的不断发展，肿瘤相关基因在滋养细胞肿瘤中的研究日益进展。IMP3是一种新识别的癌胚核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)结合蛋白。IMP3基因是人胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白家族(IMP1，IMP2，IMP3)的成员之一，该家族成员在胚胎形成早期的RNA运输、稳定、细胞生长和迁移中起着重要作用[4-5]。近年来研究发现，IMP3可能参与多种肿瘤的发生，发展而受到广泛关注，有可能成为一种新的肿瘤标记物。

研究表明，IMP3基因在大鼠和人类早期胚胎发育时期在胎盘组织中有表达，而在正常成人组织中几乎无表达。妊娠滋养细胞疾病是一组来源于胎盘滋养细胞的疾病，滋养细胞来源于胚胎的胚外层细胞。HCG是滋养细胞疾病特异及敏感的肿瘤标记物，是诊断与治疗监测的主要参照指标，HCG＞10万和年龄＞40岁认为是与HM发生局部转移和(或)远处转移和滋养细胞肿瘤预后有关的高危因素。

本研究结果显示，IMP3基因在40岁以上HM患者组织中高表达，且在血清β-hCG＞2×105mIU/ml时表达率较血清β-hCG＜2×105mIU/ml时明显升高，提示IMP3可能参与了HM的发生发展，故其在HM发生局部侵蚀和远处转移方面具有一定的预测作用。在40岁以上IHM患者组织中，IMP3亦有表达，在血清β-hCG＞2×105mIU/ml时IMP3的阳性表达率高于血清β-hCG＜2×105mIU/ml，两者比较差异有统计学意义，提示IMP3对于滋养细胞肿瘤的病情评估预后观察可能有指导意义。HM是滋养细胞的异常增殖所形成，可对子宫肌层和血管发生侵袭，甚至远处转移。滋养细胞具有取代血管内皮细胞形成血管内壁的亲血管性特点，因此该类肿瘤极易侵蚀子宫肌层血管，并在疾病早期即可发生血行转移至身体其他脏器。IMP3与胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)结合可以调节IGFs与IGF2型受体间的相互作用，改变其促有丝分裂效应、凋亡抑制效应和促细胞运动的作用[6-7]。Bae等[8]研究发现，IGF-2可以促进肿瘤血管和淋巴管的生长，降低IGF-2信使RNA结合蛋白IGF-2的分泌，可以减少体外肿瘤细胞的增殖和活体肿瘤的生长。因此，IGF2 BP3/IGF-2途径在HM发生侵蚀和转移方面可能起到一定的作用。

IHM继发于HM之后，是一种妊娠滋养细胞肿瘤，临床表现为恶性病变且多伴有局部侵袭和远处转移，需要化疗，绝大部分病例均可通过大剂量化疗达到治愈，是少数可以治愈的实体肿瘤之一，但部分病例需要化疗联合手术或放射治疗等辅助治疗手段。滋养细胞疾病的原发灶在子宫，主要通过血行转移，宫旁血管常异常充盈怒张，血管内常有瘤栓存在，甚至可见到水泡状组织。有学者报道，对无生育要求的耐药患者采用化疗联合手术治疗的方案，既可缩短治疗时间，还可减少复发的风险。对经过多疗程化疗后血清β-hCG值下降不明显，而其他部位转移灶明显吸收的患者，如怀疑子宫病灶耐药亦可在更改化疗方案的同时进行子宫切除术，以改善治疗效果，提高肿瘤缓解率。妊娠滋养细胞肿瘤盆腔血供丰富，易出血及发生癌细胞扩散，并有肺血管栓塞可能，除急诊情况为抢救患者生命外，对有手术切除子宫指征的患者，术前应先进行数个疗程的化疗。大量资料证实，预防性化疗可以使IHM的发生率下降近一半，应对有恶变高危因素的HM患者给予预防性化疗[9]。

妊娠滋养细胞肿瘤患者行子宫切除手术的适应证为：①年龄大，不希望再生育者，在短期化疗后行子宫切除术；②尽量使病灶局限，以减少术中出血，并彻底清除病灶；③子宫病灶已耐药者行子宫切除术；④子宫破裂者行子宫切除术，对无生育要求的患者采用化疗联合手术治疗的方案，既可缩短治疗时间，还可减少复发的风险。

对有手术切除子宫指征的患者术前应先进行数个疗程化疗，待病变基本控制稳定后再行手术，这样不仅能保证手术过程顺利，术中出血少，而且手术也能更为彻底[10]。对于年龄＞40岁的妇女，由于生理机能的特点，妊娠后发生IHM及恶变率的概率较年轻育龄妇女明显增加，对其的身心健康和生命危害极大，亦极易引起误诊，使患者不能得到及时治疗而影响其预后[11-12]。研究发现，IMP3可以介导激活IGF-2的翻译而促进人类白血病细胞的增殖，IMP3还可以通过和靶信使RNA结合来调整信使RNA的转移、粘附和运输，化学药物抑制了滋养细胞的增殖，从而使IMP3的表达下降，通过与靶信使RNA结合的IMP3蛋白减少来抑制肿瘤信使RNA的转移、粘附和运输，从而使滋养细胞的数量减少和活性降低[13]。

有文献报道，恶性滋养细胞疾病患者的血清HCG分泌量与癌细胞总数以及病情严重程度呈正相关[14]。因此，在对实施手术后的滋养细胞肿瘤患者应继续化疗数个疗程，以进一步杀死和灭活潜藏于病灶内的滋养细胞，以达到治愈和防止肿瘤复发的目的。滋养细胞疾病患者多数可治愈，病死率明显降低，但其可发生局部侵袭和远处转移，具有降低细胞粘连、对细胞外基质的降解等多数肿瘤的分子生物学特征。Findeis-Hosey等[15]研究报道，IMP3可调节细胞外基质和细胞粘连蛋白，稳定粘附因子CD44及信使RNA从而促进神经癌细胞的形成。

妊娠滋养细胞疾病具有极强的亲血管性，在其发生与转移过程中，必须多次溶解血管内皮基底膜及细胞外基质，来促进细胞恶变及转移的发生。在妊娠早期，即胚泡和胎盘形成时期，滋养细胞表达和分泌较多的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，分解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，启动滋养层粘附、迁移和分化，使滋养层穿透基底膜到达母体循环，促进胚胎种植[16]。而滋养细胞肿瘤的滋养细胞则失去控制，不断浸润溶解子宫内膜基质，从而进一步恶化及转移。因此，在后续研究中可通过检测血液中IMP3的表达情况进一步研究IMP3在滋养细胞肿瘤及其他妇科肿瘤中的情况，使其成为简便实用的肿瘤标志物，有利于了解肿瘤的发生、发展及疾病的诊疗和预后观察。

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