松树抗松材线虫病机制研究进展

邱秀文，何龙喜

(1.九江学院鄱阳湖生态经济研究中心，江西 九江 332005； 2.江西省林业有害生物防治检疫局，江西 南昌 330038)

松材线虫病(Pine wilt disease)是由松材线虫Bursaphelenchusxylophilus引起松属Pinus树种毁灭性死亡的一种世界性森林病害。由于该病害具有传播速度快，致死率高，防治难度大，生态损失重等特点，被称为“松树的癌症”。该病害在原产地北美洲未对松树造成严重危害，而在传入地中国、日本、韩国、葡萄牙和西班牙却导致大量松树感病死亡，给国民经济和生态环境造成了严重损失[1-3]。近年来，很多学者对松材线虫及其相似种的形态结构、致病力差异、繁殖力差异、基因组以及致病相关基因等进行了大量研究，以期阐述松材线虫病致病机理[4-9]。但目前有关松材线虫病致病机理仍然不清楚，这给防治工作带来了巨大困难。有学者从松树与松材线虫互作关系出发，对松材线虫侵入后寄主细胞的生理生化响应、次生代谢物质的产生和组织病理学变化等进行了研究，认为寄主抗病反应所产生的特异性次生代谢物质可能是致病因子或促进了松树的死亡[10-13]。松材线虫病是松树与松材线虫互作后，线虫突破寄主的防御系统，最终导致松树整株感病死亡[12-14]。因此，研究松树抗松材线虫机制，对阐述松材线虫病的致病机理和开展松材线虫病可持续性防控具有重要的意义。

1 松树与松材线虫互作中的组织病理学研究

松树感染松材线虫后的症状发展被划分为早期和后期两个阶段[14-15]。在感染松材线虫早期，松树接种点附近的皮层细胞和部分木质部射线细胞被破坏，松树树脂减少或停止分泌，树脂道周围的薄壁细胞开始降解，这种生理和组织病变随着线虫在寄主体内迅速扩散而扩展到整个植株[15-16]。有研究发现感染松材线虫的黑松Pinusthunbergii薄壁细胞中的液泡变大[17]。但是，用无毒的拟松材线虫Bursaphelenchusmucronatus接种黑松后，薄壁细胞液泡胀大的现象仅出现在接种点周围的有限区域内[17]。在病害发展的后期，松树薄壁细胞的死亡和表皮、韧皮部、形成层的降解扩展到整个植株，同时伴随着蒸腾作用的减弱和水分疏导受阻，最终导致松树死亡[6]。松树细胞膜脂的过氧化水平能表征细胞膜的伤害程度，其经常在抗、感病反应中增加。通过组织病理学观察，发现寄主的部分薄壁细胞坏死时，膜脂过氧化反应逐渐发生，且氧化水平的增加与细胞的降解、坏死及线虫的繁殖同时进行。可见，松树在感染松材线虫病后，薄壁细胞随着线虫在寄主体内迁移而不断死亡，树脂道遭到破坏，树脂分泌停止，蒸腾作用减少等是松树感染松材线虫病的重要病理学特征。

2 松树抗松材线虫入侵的生理生化响应研究

2.1 松树抗病反应中的信号转导研究 有研究表明松树组织的坏死或过敏性死亡(HR)是寄主与松材线虫互作过程中的一些信号分子诱导产生的[11-13]。在松树感病早期，其体内乙烯含量的增加被认为是松树抗病反应中的重要信号[17]。在不同抗性的松树中，乙烯的产生与松树抗病机制之间的关系存在差异。乙烯在高抗的火炬松P.taeda及抗性选育存活的黑松和赤松P.densiflora中，产生时间较易感病的松树早，且易感病松树感染松材线虫后，乙烯的产生先是立即减少，随着线虫的增殖而大量产生，最后导致植株死亡[18-21]。火炬松接种松材线虫后，其体内乙烯出现暂时积累和部分管胞空穴化；而乔松P.griffithii感病后尽管出现了乙烯积累，但几乎找不到管胞空穴化的出现[17,19]。这表明乙烯在火炬松和乔松抗病反应中的作用机制存在差异。有研究发现用弱毒的松材线虫接种松树后，并未导致乙烯的产生；而在接种弱毒松材线虫又受水分胁迫的松树中，乙烯的释放更快速，且产生量更多[6]。有研究发现松材线虫分泌的纤维素酶、果胶酶等诱导了松树中乙烯的释放[6，17]，这表明松树体内乙烯产生的强度高低与松材线虫的致病力和环境胁迫关系密切。松树在感染松材线虫早期，随着细胞膜脂过氧化反应增加，薄壁细胞坏死数量增多[19]。活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)等在松树感病早期细胞膜脂出现过氧化反应和细胞内含物泄漏之前大量产生，而这些化学分子是诱导细胞死亡的重要信号物质[11-13]。有研究表明火炬松、马尾松P.massoniana和黑松感染松材线虫后，活性氧和NO变化存在差异，与松树的抗性和病程的发展密切相关[11-13]。由上可知，乙烯、活性氧、NO等是松树抵御松材线虫入侵的重要信号分子，转导了寄主的抗病反应。但是，有关松树与松材线虫互作中信号分子关联性研究，以及其转导通路研究报导较少，还不能全面揭示松树抗松材线虫机理。

2.2 松树抗病反应中的大分子化合物研究 松树感染松材线虫后，其体内蛋白质含量和酶活性的变化也是松材线虫病的重要生理生化特征[22-23]。在感病早期，松树体内蛋白质含量、过氧化物酶活性、酚类氧化酶活性等明显增加，膜脂也开始氧化[23]。同时，松树体内的糖类物质浓度显著下降，其有关次生代谢物质的产生和酶活性增加的反应开始出现[22]。因此，松树体内糖类物质含量的降低可能是由其感染松材线虫后呼吸作用的加强所导致的，但是这种呼吸作用的加强和能量产生的增加是脱离的，从而导致形成层细胞分裂明显减少，松树生长量减少。有研究发现健康的火炬松、硬叶松P.rigida体内含有一种可溶解于水的化合物，其活性可抑制松材线虫的扩展，且这种物质的活性会因松材线虫或无毒的拟松材线虫诱导而增强[14,23]。有研究表明马尾松种源体内的游离氨基酸含量高低与抗松材线虫能力呈负相关[20]。可见，不同的松种其抗病机制存在差异，有的松树可能存在固有的抗病物质或结构，有的可能需要病原诱导产生抗性。有研究表明在松材线虫大量繁殖之前，随着感病松树体内薄壁细胞中液泡的扩展，丹宁酸的含量也不断增加。但是在线虫繁殖盛期及松树萎蔫症状出现时，却未发现大量的丹宁酸[19,21]。而用无毒的拟松材线虫接种黑松，却没有发现丹宁酸的含量发生显著变化[20]。由此可见，丹宁酸的产生是松树感染松材线虫病程度高低的重要生理生化指标。现已证实松材线虫能分泌许多大分子化合物，如纤维素酶、果胶酶、过氧化氢酶、蛋白酶和淀粉酶等。松材线虫病的病理反应可能是由一种或几种大分子化合物主导,也有可能是由多种大分子化合物共同参与作用的结果。

2.3 松树抗病反应中产生的植物毒素研究 许多研究表明，受害松树木质部薄壁细胞和树脂道薄壁细胞在松材线虫到达之前就发生了病变和死亡，并认为这种现象可能与松树感病后产生的异常代谢物质有关[27-28]。Oku首先提出松材线虫发病可能涉及植物保卫毒素[22]。自20世纪80年代以来，研究者先后从感染松材线虫的松树体内分离到苯甲酸(BA)、儿茶酚(CA)、8-羟基香芹软酮(8-HCA)、二氢松柏醇(DCA)和10-羟基马鞭烯酮(10-HV)、苯乙酸(PA)和2-甲氧基肉桂酸等植物毒素，并证明这些毒素与松树萎蔫有直接关系[8]。BA、CA对松树的毒性比DCA、PA和8-HCA强[8]。这些有毒物质主要是在松树抵抗松材线虫入侵过程中产生的一些次生代谢物质。Zhang等对抗性和易感病黑松分别接种松材线虫后的代谢物进行了分析比较，发现在线虫增殖阶段，亚油酸(LA)在抗性黑松中的含量是易感病黑松品种的2倍；苯甲酸在抗性黑松中含量很低，但在易感病的品种中则随着线虫数量的快速增加而迅速积累[26]。同时，研究还发现在感病黑松中内源杀线虫物质银松素和银松素甲基谜显著高于抗性品种[26]。有研究表明在樟子松P.sylvestnis接种松材线虫后，其体内具有杀线虫作用的脱氢松香含量增加，而在健康的樟子松中含量丰富的松香酸却没有杀线虫活性[27]。这暗示松材线虫可诱导松树产生一些植物毒素，抵御线虫入侵，但是过多的植物毒素积累会对自身细胞组织造成伤害。因此，松树产生植物毒素的代谢途径可能是松树抗病的重要机制。随着研究的不断深入，更多的毒素将会被分离和鉴定，究竟是哪一种毒素在松树萎蔫过程中起主导作用及相关作用机制仍然不清楚。

3 松树抗松材线虫病分子生物学研究

近年来，有关松树抗松材线虫病的分子生物学机理研究成为热点，并通过转录组学和基因组学发现了一些与松树抗病相关的基因。Kuroda等对不同抗性赤松接种松材线虫后的转录组学进行了分析，发现ESTs基因序列在抗性赤松中较感病的更丰富，认为这种现象是由于松材线虫诱导了抗性赤松的相关抗性基因的表达，而在易感病的品种中抗性基因表达受到了一定的抑制，或者是抗性信号转导受到了阻碍，导致ESTs基因序列较少[29]。同时，研究发现黄酮类、酚类化合物合成相关基因在抗性松树中表达明显高于感病松树；一些病程相关蛋白(PR蛋白)在感病赤松上出现了上调表达，而在抗性品种中未被发现[29]。Nose等对抗、感病的黑松接种松材线虫后的基因表达进行了比较分析，发现抗性黑松品种在接种线虫后，PR-2、PR-4、渗调蛋白、脂肪氧合酶、查尔酮合酶等蛋白基因表达出现了明显上调；过氧化物酶、水解酶相关基因在抗性品种中较易感病的上调表达更显著[30]。这些差异表达的基因可能反映了抗性和易感病黑松对松材线虫的抗性差异[30]。Xu等对马尾松感染松材线虫早期的基因表达进行了研究，发现接种72 h后，应激反应相关基因开始出现高表达，马尾松树体内的水解酶基因表达较丰富，而解毒相关基因和氧化还原酶基因表达较少[31]。这些与松树抗松材线虫相关的分子生物学研究为寻找抗性基因，并通过基因克隆和基因融合技术应用于抗性育种，奠定了理论基础，也为阐明松材线虫分子致病机理提供了参考。

4 松树抗病反应对松材线虫扩展和繁殖的影响

研究松树对松材线虫的抗病反应是阐释松树抗病机制的重要途径。松树的抗病反应不仅可以阻碍松材线虫在松树体内迅速扩展，而且能抑制线虫在寄主体内迅速繁殖，从而延缓松材线虫病的发展。有研究表明松材线虫在火炬松体内的移动速度较感病的黑松慢。但是不管在抗性松树还是易感松树中，线虫仍能分布到整个松树体内[3]。有研究表明松材线虫很难侵入火炬松的组织，即使侵入也不能马上增殖；但能侵入抗病的乔松、感病的黑松和赤松组织[3,19]。并且研究发现在乔松感染松材线虫的早期和扩展期的组织形态学存在着明显的不同[3,19]，这种差异与乔松接种松材线虫后的动态防卫反应较一致。Zhang 等比较分析了接种2周至1个月后的抗性黑松和感病黑松体内的松材线虫数量，发现线虫在感病黑松体内迅速增殖，而在抗性黑松中增殖较慢[26]。有研究发现松材线虫刚侵入乔松时迁移速度较在火炬松中快，这可能是因为在火炬松中本来就存在着某些抵抗松材线虫入侵的物质；而乔松在松材线虫诱导下才产生大量的植保素，以致线虫数量下降，甚至被消灭[3]。结构性抗病方面，在健康的火炬松中观察到，其能阻碍线虫的移动并抑制线虫的繁殖。有研究发现松材线虫能在死亡的火炬松中繁殖，这表明抗性松树的抗病性只有在其健康状态下才表现明显。另外，通过离体的松树枝条试验，发现在没有提供足够营养和能量的条件下，松树对松材线虫的防御反应会长时间瘫痪。黑松针叶的去除和对其进行光反应的抑制处理能够使弱毒松材线虫和拟松材线虫在黑松体内繁殖，并最终导致黑松死亡[21-22]。同时，也有研究表明水分胁迫也能加速松材线虫病的发展[17]。因此，松材线虫入侵松树后迁移和繁殖与松树的结构性抗病和诱导性抗病密切相关，同时也受环境因素的影响。筛选结构性抗性基因对抗性育种具有重要的意义。

5 总结

松树体内存在许多抵御松材线虫入侵的相关因子，并且不同松种的抗病机制可能存在差异。松树在感染松材线虫后，其体内的生理生化反应如乙烯的产生、丹宁酸的积累、膜脂过氧化反应、过氧化物酶活性增加和呼吸作用增强等不是同时产生的，而是在一系列的反应中相互替代而相互联系的。这些反应都是松树抵御松材线虫入侵的生理生化响应，且相互替代导致了松材线虫病的不断扩展，加速了松树感病死亡。因此，上述相关松材线虫病中的生化反应可能是松材线虫病致病机理的重要组成部分。但是，目前的研究往往只关注于松树抗病反应中某一方面的因子，对各因子之间的联系研究较少。另外，松材线虫入侵松树后，对寄主与线虫互作方面的研究也不够深入，有些抗病反应远比现在已认识到的复杂。同时，阐释寄主抗病反应的机理在选育抗性的松树品种和家系中具有重要的指导作用。因此，要加强有关松树与松材线虫互作后的反应及其分子生物学领域的研究，并把不同的生理生化反应和代谢途径联系起来，阐明松树抗病反应中的信号分子及信号转导通路。这些研究对阐述松材线虫病的致病机制和松树的抗病机制以及指导抗性育种工程的实施都具有重要的意义。