Wnt信号通路上关键基因在哈萨克族食管癌中的表达*

张静， 闫新玲， 马遇庆， 罗丹， 张亚静

830000 乌鲁木齐，新疆医科大学附属中医医院 病理科 (张静、罗丹、张亚静)；830000 乌鲁木齐，乌鲁木齐市中医医院 病理科(闫新玲)；830054 乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院 病理科(马遇庆)

食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一[1]食管癌依据WHO组织学分类主要包括鳞癌和腺癌两种，其中鳞癌占90%。我国是食管癌高发地区，占全国肿瘤死亡率21.8%[2]。新疆哈萨克族食管癌发病率明显高于其他民族。食管癌的癌变是一个多步骤、多因素的过程，其发生发展过程与多种基因的异常表达有关[3]。Wnt信号通路是由Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等组成的复杂信号途径,是调节增殖生长的关键途径[4],对细胞增殖、分化和凋亡等起重要的调控作用。越来越多的证据表明,Wnt信号途径异常激活参与了多种人类肿瘤的发生。因为肿瘤分布具有地域差异，欧美国家对此通路的研究多集中于结肠癌、前列腺癌及乳腺癌中[5-7]，对于该通路在食管癌中的研究相对较少。CK2(蛋白激酶)和SFRP2(泌型卷曲相关蛋白2)是Wnt信号通路上的关键基因，本文旨在研究食管鳞癌中二者在Wnt信号通路上相互作用及与其他临床资料的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2007年～2014年在新疆医科大学第一附属医院经手术病理证实的原发性食管鳞癌患者75例，均为哈萨克族，术前均行钡餐、B超、活检等确诊为原发食管鳞癌。75例均表现为不同程度的进行性吞咽困难，同时伴有营养不良，消瘦等症状，其中男性51例，女性24例，年龄39～80岁，平均(53±6)岁。

1.2 检测方法

1.2.1 免疫组化染色 将食管鳞癌组织置于65℃烤箱中，2h后脱蜡，水化，用PBS充分冲洗，孵育15min，再次冲洗，用枸缘酸盐溶浸润玻片和切片架，高温加热，冷却后PBS冲洗3遍,共10min，钟；加入1∶200的CK2和SFRP2一抗，置于4℃的环境下过夜；PBS冲洗，滴加二抗，孵育90min，DNA显色，常规脱水，封片。

1.2.2 结果判定 表达程度判定标准[8-9]: 免疫组化结果由2 位病理医师共同判定(CK2的Kappa值为0.939，P<0.01；SFRP2的Kappa值为0.877，P<0.01)。双盲法在每张切片随机选取10个高倍视野(400×倍)，每个视野500～1 000个细胞。从以下2方面对切片进行计分:①染色强度:0分为无着色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;②阳性细胞数:1分为1%～10%，2分为1l%～50%，3分为51%～75%，4分为≥76%。将两项评分相乘得出最终结果:阴性(-):<3分，阳性(+):≥3分。CK2在肿瘤细胞的细胞核或细胞浆表达，呈褐色或黄褐色颗粒分布。SFRP2在肿瘤细胞的细胞核或细胞浆表达，呈褐色或黄褐色颗粒分布。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 哈萨克族食管鳞癌的临床病理特征(表1)

表1 哈萨克族食管鳞癌患者临床病理特征

2.2 CK2在食管鳞癌及癌旁组织中的表达

CK2定位于肿瘤细胞的细胞核或细胞浆中，见图1。CK2在食管鳞癌组织中阳性率为68%，在癌旁组织中阳性率为28%，表达明显高于癌旁组织，两者阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 CK2在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达

2.3 哈萨克族食管鳞癌临床病理参数与CK2表达的关系

CK2表达与肿瘤浸润程度相关(P<0.05), CK2表达与其他临床病理参数无关(P﹥0.05)。见表3。

表3 哈萨克族食管鳞癌患者临床病理参数与CK2表达的关系

(接下表)

(续上表)

变量哈萨克族CK2-(n=24)CK2+(n=51)x2P值淋巴结转移0.04>0.05 有716 无1735血管侵犯0.05>0.05 有49 无2042神经侵犯0.46>0.05 有412 无2039

2.4 SFRP2在食管鳞癌及癌旁组织中的表达

SFRP2在肿瘤细胞细胞核或细胞浆表达，见图1。食管鳞癌中SFRP2阳性率为29.3%，癌旁组织中阳性率为70.7%，SFRP2在癌旁组织中的表达明显高于癌组织，两者阳性率之间差异有统计学意义(P<0.01)。见表4

表4 SFRP2在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达

2.5 哈萨克族食管鳞癌患者临床病理参数与SFRP2表达的关系

SFRP2表达与临床病理参数无关(P>0.05)。见表5。

表5 哈萨克族食管鳞癌患者临床病理参数与SFRP2表达的关系

(接下表)

(续上表)

变量哈萨克族SFRP2-(n=53)SFRP2+(n=22)x2P值类型1.94>0.05 溃疡型3213 髓质型63 缩窄型123 蕈伞型33肿瘤大小0.39>0.05 ≥3cm3312 <3cm2010分化程度1.89>0.05 高114 中3417 低81浸润深度2.70>0.05 粘膜2112 肌层95 其他235淋巴结转移0.48>0.05 有158 无3814血管侵犯0.04>0.05 有103 无4319神经侵犯0.55>0.05 有133 无4019例数5322

2.6 食管鳞癌中CK2和SFRP2的表达的相关性

在哈萨克族食管鳞癌组织中，CK2 和SFRP2均阳性者为11例，CK2阳性而SFRP2阴性者为40

例，CK2阴性而SFRP2阳性者为11例，二者均阴性者13例，两者呈负相关(P<0.05)。见表6。

表6 食管鳞癌中CK2和SFRP2的表达的相关性

3 讨 论

近年的临床流行病学研究发现[8]，食管癌的发生率、死亡率逐年上升，已经成为学界普遍关注的热点问题。我国每年因食管癌死亡的人数在15万以上[9]，且呈逐年递增趋势[10]。食管癌的发病年龄多在40岁以上，女性少于男性。目前食管癌发病原因尚未明了。在生物进化过程中Wnt信号通路是一条极为保守的通路,当细胞分化成熟时处于关闭状态，近年来研究[11]表明，Wnt信号通路异常可引起人类多种恶性肿瘤。与消化道肿瘤的发生、发展也关系密切，研究揭示食管癌的发生、发展和Wnt信号通路中各成分的变化密不可分。其中CK2和SFRP2是Wnt信号通路上的关键基因。在Wnt通路中，CK2是真核生物细胞中普遍存在的、多功能蛋白激酶，具有高度多效性，能使细胞内300多种底物磷酸化，对细胞迁移、增殖、凋亡、分化和血管再生具有重要的作用[12]。CK2作为β-catenin降解复合物上游的激酶通过β-catenin(β-catenin分子参与多种肿瘤的发生过程[13-14])对Wnt通路中的靶基因发挥重要的调节作用，有研究证实在Wnt通路中,CK2可能发挥正调节作用[15]。Wnt信号通路的负性调控因子SFRP2被认为是Wnt信号通路最为强大的拮抗剂[16]。而SFRP作为Wnt信号途径的抑制剂，其结构与Fz受体极为相似，具有同源的配体抑制区，通过竞争性结合Wnt蛋白而抑制Wnt的活动[17]。如果SFRP2表达下调或缺失,对Wnt信号通路的抑制作用减弱或消失,从而促进肿瘤的发生发展。但是在食管癌形成过程中所发挥的作用,目前尚不清楚[18]。CK2和SFRP2联合检测在新疆哈萨克族食管鳞癌的研究很少[19]。本研究发现：CK2在食道鳞癌中高表达，在癌旁组织低表达(P<0.05)，验证了CK2在Wnt通路中可发挥正调节作用。SFRP2在食道鳞癌中低表达，在癌旁组织高表达(P<0.05)，说明作为抑癌基因的SFRP2在肿瘤的发生发展过程中表达下调或缺失，失去了对肿瘤的抑制作用，促进肿瘤发生发展。这些基因在食管癌及癌旁组织中表达有差异[20]。在与临床病理参数的联系中，我们发现只有CK2与肿瘤的浸润深度有关，说明作为Wnt信号通路正向调节因子，CK2不断促进肿瘤的浸润发展。CK2和SFRP2与其他临床参数均无关，考虑因为样本量的关系，有些关系并未真实的展现出来，我们在后续的研究中，将进一步增加样本量，继续探讨CK2和SFRP2与临床参数的关系。研究还发现：在食管鳞癌中CK2和SFRP2的表达呈负相关。在激活的Wnt通路中Wnt蛋白与细胞跨膜受体Fz等结合后,触发细胞内的转导信号,抑制β-catenin降解复合物在细胞质内形成,而CK2作为β-catenin降解复合物上游的激酶可直接或间接使β-catenin磷酸化，导致细胞质内β-catenin积累并转移至细胞核内,继而与转录因子TCF/LEF相结合,引发Wnt信号靶基因的转录,促进细胞生长。而作为Wnt信号途径的抑制剂的SFRP，其结构与Fz受体极为类似，具备同源的配体抑制区，通过竞争性结合Wnt蛋白进而阻止Wnt蛋白与Fz的结合最终抑制Wnt的活动。所以CK2和SFRP2两者在Wnt通路中功能是拮抗的。与本文结论一致。

图1 CK2和SFRP2在食管鳞癌及癌旁组织中的免疫组化表达

a.ck2癌细胞核阳性表达(10×10);b.ck2癌细胞核阳性表达(40×10);c.SFRP2癌细胞浆阳性表达(10×10);d.SFRP2癌细胞浆阳性表达(40×10);e.SFRP2癌旁组织浆阳性表达(10×10);f.ck2癌旁组织阴性表达(10×10) ;g.SFRP2癌细胞阴性表达(10×10)

综上所述：食管癌是消化道最为常见的恶性肿瘤之一。在我国食管癌发病率、死亡率在界范围内均处于较高水平[21]。在食管鳞癌中，CK2高表达与SFRP2低表达共同促进了肿瘤的发生发展。SFRP2表达下调可能使其拮抗Wnt信号通路的功能减弱， CK2正调节Wnt通路中，使Wnt持续存在，导致肿瘤发生。CK2和SFRP2可能为预防食管鳞癌以及食管鳞癌早期诊断和预后评估提供了新的思路。

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