基于COI与SRY序列建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的分子鉴别方法

魏艺聪+蒋超+袁媛+赵玉洋+金艳+黄璐琦

[摘要] 为了建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的特异性PCR鉴别方法。采集不同来源的梅花鹿、马鹿鹿及其杂交鹿的鹿角或鹿茸样品共48份，其中24份为市场流通的待测样品。分别利用COI与SRY基因序列作为其父母本的鉴别标记，对已知样品的COI与SRY基因进行扩增、测序，进行同源比对后根据其变异位点设计特异鉴别引物，分别基于COI与SRY基因建立对梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸的特异PCR鉴定方法，并随机对市场流通的24份待测鹿茸样品进行鉴别分析。该实验所构建双位点特异PCR体系，基于COI的鉴别位点，可通过PCR扩增获得232 bp的梅花鹿特异片段，而产生518 bp的马鹿特异片段；而基于SRY的鉴别位点，通过PCR扩增获得803 bp的梅花鹿特异片段，而产生425 bp的马鹿特异片段。随机抽取市场流通中的24个待测鹿茸样品，经鉴定有3个样品屬于马·花杂交的鹿茸样品。该实验建立对梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠。

[关键词] 梅花鹿； 马鹿； 杂交； 双位点特异PCR体系； COI； SRY

[Abstract] For rapid identification of Cervus nippon， C. elaphus and their hybridize samples， the specific PCR for mutual authentication of them was established based on the SNPs in COI and SRY sequence. C. nippon， C. elaphus and their hybridize samples were collected from different origins， total DNA of 24 identified samples were extracted， and the COI and SRY gene was seqenced. SNPs in the COI and SRY sequences of the samples were found by Clustul X 2.1 program. Primers for identifying C. nippon and C. elaphus were designed according to the SNP site， two multi-PCR reaction system were established to identify them. In addition， 24 samples which were randomly collected in different herbal medicine market were identified. The band special for C. nippon （232 bp）and band special for C. elaphus （518 bp） based on COI sequence，and the band special for C. nippon （803 bp）and band special for C. elaphus （425 bp） based on SRY sequence， were found using multi-PCR reaction， and three of the twenty-four samples were identified as the hybridize samples. The multi-PCR reaction system could be used to identify C. nippon， C. elaphus and their hybridize samples .

[Key words] Cervus nippon； Cervus elaphus； hybridize； multi-PCR reaction system； COI； SRY

鹿茸是我国传统名药之一，始载于《神农本草经》，具有促进生长发育、强壮身体、抗炎、免疫调节、抗衰老、促进创伤愈合等功能[1-4]。《中国药典》规定鹿茸基原为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck 或马鹿C.elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，作为名贵中药材品种，鹿茸在市场上供不应求且价格昂贵。

杂交有利于提高畜牧产量，我国的茸鹿种间和亚种间的杂种优势利用一直处于国际领先水平，早在1958年吉林省吉林市龙潭山鹿场即用本交的方法开展家养马鹿（♀）与梅花鹿（♂）杂交（简称马·花杂交）试验研究，随后茸鹿的杂交育种技术得到推广与应用。其中，马·花杂交被认为经济性状最佳杂交组合之一[5-6]。导致中药市场中除了出现驯鹿、白唇鹿、水鹿等常见动物的茸片等混伪品，还常出现马·花杂交鹿茸或花·马杂交鹿茸。而这些鹿茸品质特征并不一致，如赵磊等对梅花鹿茸、马鹿茸、花马杂交鹿茸等5种鹿茸的常规成分、无机元素和氨基酸含量进行了测定，结果表明梅花鹿茸与花马杂交鹿茸无机元素等营养成分存在差异[7]。另一方面，也缺乏准确可靠的杂交鹿茸鉴别方法，依据外部形态、显微特征、理化性状的传统鉴定方法对马鹿与梅花鹿的杂交鹿茸鉴定存在很大困难。因此，对鹿茸药材进行正本清源，特别是对杂交鹿茸的鉴别，对保障药材质量具有重要的意义。

分子标记方法具有灵敏性高、准确性好、客观性较强等优势，目前在鹿茸等贵重药材及其原动物的分子鉴定方面有不少文献报道，比如基于COI或Cyt b片段的鹿茸类药材分子鉴定的相关文献报道[8-9]。而以COI基因是线粒体DNA，属于细胞质遗传，只能作为鉴别其母本的证据，因此，为了建立对杂交鹿的分子鉴别，还需要Y染色体的上基因作为父本的鉴别标记，其中，Y染色体上的SRY基因作为哺乳动物的性别决定基因，在不同物种间SRY基因的位置、大小、结构等均不相同[10]。因此，SRY基因在分子进化领域得到了广泛应用[11]。本实验拟利用COI和SRY基因建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸样本的分子鉴别方法。endprint

1 材料

1.1 仪器 微量分光光度计（Nanodrop 2000，Thermo Scientific 公司）； Veriti PCR仪 （Applied Biosystems），5810R 型低温冷冻离心（ Eppendorf公司），ND-100型核酸蛋白分析仪（Gene 公司），DDZ-11型电池式电动骨钻（上海医疗器械集团） 。

1.2 试剂及样品 TIANDZ柱式骨骼DNAout购自北京天恩泽公司；DL 2 000 plus DNA Marker购自Takara 公司；多重PCR 5×Master Mix购自NEB公司，FastTaq DNA聚合酶购自TransGen公司。三氯甲烷购自北京化工厂，均为国产分析纯。鹿茸药材包括马鹿、梅花鹿及其混伪品，共计48个样品，分别购自新疆、吉林、安徽、湖南、重慶、广西、云南、北京、广州等地，样品由金艳鉴定，药材标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。

2 方法

2.1 基因组DNA的提取和纯化 取药材样品，经过75%乙醇表面消毒后，利用骨钻钻取20 mg 样品粉末，饮片则直接粉碎，采用TIANDZ 柱式骨骼DNAout 提取鹿茸总DNA，作为模板用于鹿茸DNA鉴别研究。

2.2 通用引物扩增COI与SRY基因序列 应用通用引物CO-F与CO-R扩增COI基因序列，PCR 反应程序为：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，45 ℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5个循环；95 ℃，1 min，50 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃，7 min。获得PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳，并用EB染色观察，由生工（上海）有限公司测序。

应用通用引物SR-F与SR-R扩增SRY基因序列，PCR反应程序为：95 ℃预变性23 min后，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环后72 ℃延伸7 min。获得PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳，并用EB染色观察，由生工 （上海） 有限公司测序。

2.3 鉴别标记获得与引物设计 根据测序所获得的受试样品的COI，SRY基因序列，并从NCBI数据库中下载梅花鹿、马鹿、驯鹿、水鹿等物种的COI，SRY基因序列，利用ClustulX 2.1软件进行同源对齐，校对后分析其特异性SNP位点，并从特异性SNP 位点中筛选合适的鉴别位点，使用Primer Premier 5.0设计出梅花鹿、马鹿的特异性鉴别引物。以梅花鹿COI序列JF700150.1 为参照，选择COI序列第391位的梅花鹿特异性SNP位点C作为鉴别位点，设计特异识别梅花鹿的引物CCnF；而以第106位的马鹿特异性SNP位点C作为鉴别位点，设计特异识别马鹿的引物CCeF；并设计共同的反向引物CCR。梅花鹿SRY序列AB915321.1为参照，选择SRY序列第69位的梅花鹿特异性SNP位点C作为鉴别位点，设计特异识别梅花鹿的引物SCnF；而以第446位的马鹿特异性SNP位点G作为鉴别位点，设计特异识别马鹿的引物SCeF；并设计共同的反向引物SCR。设计的特异性鉴别引物序列见表2，由生工（上海）有限公司合成。

2.4 双位点特异 PCR扩增及电泳 分别基于COI与SRY基因序列，利用梅花鹿及马鹿的特异鉴别引物与通用反向引物分别构建1个双位点特异PCR体系：总体积20 μL，其中包括Taq DNA聚合酶1 U，5×Master Mix 4 μL，2 μmoL·L-1特异鉴别引物各1 μL，2 μmoL·L-1共同反向引物2 μL，灭菌蒸馏水补足20 μL。通过设置退火温度梯度（52，54，56，58，60 ℃）考察不同退火温度对双位点特异PCR扩增稳定性的影响。利用所构建的双位点特异PCR体系，选择最合适退火温度对候选样品进行双位点特异PCR扩增检测，循环数设置35个循环。待PCR扩增反应结束后，向反应体系加6 μL 6×loading buffer，混匀，取混合产物8 μL 点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于200 V电压的条件下电泳8～10 min，经EB显色，最后于凝胶成像仪观察记录结果。

3 结果分析

3.1 引物设计 根据测序结果及从NCBI 数据库中下载梅花鹿、马鹿、驯鹿、水鹿等物种的COI，SRY基因序列，分析梅花鹿、马鹿的特异性SNP位点，并从特异性SNP 位点中筛选合适的鉴别位点，以梅花鹿COI序列JF700150.1 为参照，选择COI序列第391 位的梅花鹿特异性SNP位点C作为鉴别位点，为提高鉴别能力，把第389位点的碱基由A替换为T，设计特异识别梅花鹿的引物CCnF；而以第106位的马鹿特异性SNP 位点C作为鉴别位点，并把第104位点的碱基由G替换为C，设计特异识别马鹿的引物CCeF；并设计共同的反向引物CCR，则可通过PCR扩增获得232 bp的梅花鹿特异片段，而产生518 bp的马鹿特异片段。以梅花鹿SRY序列AB915321.1为参照，选择SRY序列第69位的梅花鹿特异性SNP位点C作为鉴别位点，而把第67位点的碱基由T替换为A，设计特异识别梅花鹿的引物SCnF；而以第446位的马鹿特异性SNP位点G作为鉴别位点，而把第444位点的碱基由T替换为A，设计特异识别马鹿的引物SCeF；并设计共同的反向引物SCR。则可通过PCR扩增获得803 bp的梅花鹿特异片段，而产生425 bp的马鹿特异片段，见图1和表2。

3.2 建立双位点特异PCR鉴别受试梅花鹿、马鹿与其杂交鹿样品 基于基因序列，利用梅花鹿特异鉴别引物CCnF及马鹿特异鉴别引物CCeF与通用反向引物CCR构建1个双位点特异PCR体系，另 外，基于SRY基因序列，利用梅花鹿特异鉴别引物SCnF及马鹿特异鉴别引物SCeF与通用反向引物SCR构建另一个双位点特异PCR体系，通过退火温度梯度实验，分析退火温度对PCR反应效率的影响，结果显示，这2个反应体系在退火温度52～60 ℃条件下均能扩增出梅花鹿与马鹿相应的特异鉴别条带。endprint

选择退火温度56 ℃，使用以上建立的反应体系，分别对不同来源的梅花鹿、马鹿与其杂交鹿的鹿角样品进行鉴别，受试8个梅花鹿鹿角样品，7个马鹿鹿角样品及5个马·花杂交的鹿角样品分别检测到相应的阳性特异性条带，而驯鹿与水鹿等阴性样品则扩增不到条带。表明该体系具有特异性，可以直接鉴别梅花鹿、马鹿与其杂交鹿的鹿茸样，见图2。

3.3 对市场流通的待测鹿茸样品进行鉴别分析 利用以上建立的双位点特异PCR体系，对重流通市场中收集的8批待测的梅花鹿鹿茸样品、16批待测的马鹿鹿茸样品进行鉴别，结果显示受试8个待测的梅花鹿鹿茸样品的COI，SRY基因序列均属于梅花鹿，表明其父母本均为梅花鹿。而16个待测的马鹿鹿茸样品的COI基因序列均属于马鹿，而其中有3个样品的SRY基因序列并不属于马鹿，而属于梅花鹿，表明其父本为梅花鹿，即为马·花杂交的鹿茸样品（见星号标注），见图3。

4 讨论

杂交育种是选育新品种主要途径，是育种工作最重要的方法，农林杂交育种主要以经济效益为导向，育种目标包括提高抗逆，产量，品质等。对于药用动植物，育种目标既要提高入药部位的生物产量，更要提高药用成分的相对含量。其中，对于鹿茸的生产，我国早在1958年就把杂交育种技术应用于鹿茸的生产，并经1987—1992年大规模推广应用，大幅度提高养鹿业生产力和经济效益[5-6，12] 。而对于中药，杂交育种还要考虑对中药药性的影响。因此，如何鉴别杂交基原的中药材是中药分子鉴定领域重要关注点。目前，对杂交鹿茸药性药效是否与亲本一致仍无完善评价方法，且缺乏准确区分杂交与非杂交品的方法。本研究对市场流通的鹿茸样品随机选样进行鉴别分析，在24个马鹿鹿茸的待测样品就发现有3个是马·花杂交鹿茸，可见市场流通的杂交鹿茸比例较高。据报道[5]，马·花杂交F1生长速度显著高于花·马杂交F1，呈母本显性遗传，成年时体重和体型与母本鹿（马鹿）的相近，且茸生长快，其生长天数短，而茸质嫩，再生茸大、嫩又成型。而其茸型和肉质又多能呈父本显性遗传，不仅是最佳的茸肉兼用型鹿，还是茸血兼用鹿，具有较高的经济效益，这可能是市场流通中的具有较高比例的马·花杂交鹿茸的原因。而马·花杂交鹿茸的药用价值还有待进一步研究分析。

目前以线粒体序列建立的鹿茸分子鉴别方法，只能作为鉴别其母本的证据，对杂交鹿无法进行直接鉴别，为了建立杂交鹿茸的分子鉴别方法，本研究利用Y染色体的SRY基因作为父本的鉴别标记。目前，SRY基因在分子进化领域得到了广泛应用，如蔡欣等利用SRY基因多态性对牦牛与其他家牛属动物及其父系进化关系分析[11]；周盼伊等利用SRY基因进行家养梅花鹿品种Y染色体遗传多样性和父系遗传结构分析[13]；苏莹等利用Y染色体SRY基因对马鹿的遗传多样性进行研究[14]，以上研究均表明SRY基因多态性可进行哺乳动物父本的溯源分析。因此，本研究选择SRY作为杂交鹿的父本鉴定标记，结合母本标记基因COI，可有效进行杂交鹿的父母本鉴定。

本研究分别基于COI与SRY基因序列建立了2个双位点特异PCR体系，用于鉴别鹿茸样品的父母本来源，初步建立了杂交鹿茸的鉴定方法。本研究过程中，试图把2个双位点特异PCR体系优化成1个多重PCR体系，发现在同一PCR系统中，基于SRY基因的鉴别引物扩增效率很低，且不稳定，推测是同一样品中基因组DNA拷贝数远远低于线粒体DNA的拷贝数，导致PCR扩增时扩增效率显著低于基于COI的鉴别引物。后续可通过降落PCR方法等进一步优化，构建有效稳定单一的多重PCR鉴别方法，可更简便进行杂交鹿茸的分子鉴定。本研究结果对杂交鹿茸鉴别也具有实际应用价值，也为后续进行杂交鹿茸的品质评价时提供有效的鉴别方法。

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[责任编辑 吕冬梅]endprint