线粒体-锌离子-内质网与心肌缺血再灌注损伤

蔡志亮，蔡建航 综述，习瑾昆 审校

（华北理工大学医学实验研究中心，唐山063000）

急性心肌梗死引发的缺血再灌注损伤是导致高死亡率的重要原因之一，临床溶栓、介入、手术等治疗手段不仅不能恢复缺血心肌的功能，反而会加重心肌损伤和功能障碍，因此关于心肌缺血再灌注损伤的研究越来越受到重视。在再灌注损伤的机制研究中，线粒体、内质网、锌离子、活性氧、钙超载和心肌能量代谢障碍等研究均有一定进展。本文就线粒体-锌离子-内质网在心肌缺血再灌注损伤中的关系研究进展做出综述。

1 线粒体与心肌保护

线粒体是细胞中进行能量制造和有氧呼吸的场所。线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的开放是导致心肌缺血再灌注损伤的关键靶点，其开放能使分子量小于1.5kDa的物质自由流通。因此，阐明心肌线粒体保护机制能够为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供重要理论依据。

1.1 再灌注损伤补救激酶（reperfusion injury salvage kinase,RISK）通路 细胞外信号调节激酶（ERK），糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），PI3K/Akt，PKC 和 PKG 等都参与了心肌保护信号的转换。在这些激酶当中，PI3K/Akt、ERK和GSK-3β是RISK通路的主要元件。活化的Akt能够作用于下游的B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9,Caspase-9）、核因子 kB（NF-kB）和 GSK-3β 等，从而进一步调节细胞的分化凋亡等[1]。ERK的级联反应是信号转导的重要途径，当细胞受到损伤处于应激状态时，ERK被激活且表达增高[2]。ERK能够抑制促凋亡因子表达，促进细胞ATP水平的恢复和稳定，通过RISK通路来抑制mPTP的开放，在缺血再灌注损伤的心肌中发挥重要保护作用[3]。

1.2 GSK-3β GSK-3β早期仅被认为是一种调节糖原代谢的蛋白激酶，是具有多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，受丝氨酸（Ser9）和酪氨酸（Tyr216）位点磷酸化的调节。在H9c2细胞中，通过线粒体ATP依赖性钾离子通道（mKATP）的激活直接或者间接的使GSK-3β失活，抑制活性氧的生成和mPTP的开放，从而恢复线粒体膜电位，防止细胞凋亡，发挥心肌保护作用[4]。我们课题组的前期研究显示，黄芪甲苷能够显著改善再灌注损伤的心功能，减小梗死面积，其机制可能与GSK-3β失活，进而阻止mPTP的开放有关[5]。大量研究表明，抑制GSK-3β活性，阻止mPTP开放能够发挥心肌保护作用[6-8]。

1.3 线粒体呼吸链 当心肌组织发生缺血后，恢复血运是最重要的抢救措施，然而这个过程会造成氧化应激损伤、细胞凋亡和免疫应答异常等病理表现[9]。虽然缺血再灌注过程中产生线粒体活性氧（ROS）是肯定的，但是再灌注时的ROS反应细节尚未清楚[10]。研究表明，缺血期时，延胡索酸从嘌呤核苷酸中破裂溢出，与来回往返的部分倒流的天冬氨酸造成琥珀酸堆积，然后在再灌注期，堆积的琥珀酸被琥珀酸脱氢酶再氧化，通过复合物I的反电子传递，促使大量的线粒体ROS产生[11]。再灌注期的ROS爆发直接导致线粒体的氧化应激损伤和钙离子的水平调节异常，高浓度的ROS同样能够诱导线粒体渗透性转变和细胞凋亡[12]。

2 锌与心肌保护

锌离子（Zn2+）是人体健康所必须的微量元素，在生物体系中有多重作用。有研究显示，Zn2+参与到细胞内信号转导机制[13]。Zn2+非常灵活，可在细胞内转换位置发挥效应，因此其重要性和功能多样性可媲美于钙离子[14]。Zn2+的稳态主要被金属硫蛋白（metallothioneins,MTs）、锌离子运载体（Zn2+importers,ZIPs）和 Zn2+transports（ZnTs）所调控[15]。

2.1 Zn2+与RISK 最初的研究表明，Zn2+减轻缺血再灌注损伤、发挥心肌保护作用是通过激活PI3K/Akt通路，说明PI3K/Akt激活促进心肌细胞的存活和生长[16]。进一步研究显示，RISK通路中的ERK[17]和GSK-3β[18]同样能够被Zn2+磷酸化。在再灌注早期，简短的缺血/再灌注循环能够防止心肌梗死，这种现象称之为后处理[19]，出血性休克大鼠模型中，后处理能够激活RISK通路从而减轻心脏功能紊乱[20]。最近的研究显示，后处理能够增加细胞内Zn2+水平，进而抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP2A）的活性，这种心肌保护作用可能与激活RISK通路有关[21]。

2.2 Zn2+与GSK-3β 研究显示，一些细胞内信号如PI3K/Akt、mTOR、PKC和MAPKs等能够通过磷酸化Ser9使GSK-3β失活[22]。在H9c2心肌细胞中，外源性Zn2+能够使GSK-3β失活，且Zn2+对于GSK-3β活性影响的作用被PI3K抑制剂LY-294002所阻断，但mTOR抑制剂雷帕霉素或PKC抑制剂chelerythrine对此无影响，表明Zn2+的心肌保护作用可能是通过PI3K/Akt通路而并非是mTOR或者PKC来使GSK-3β失活[23]。我们的研究也表明，吗啡通过Zn2+抑制GSK-3β活性调节mPTP的开放进而保护心肌[24]。外源性Zn2+能够通过PI3K/Akt通路使GSK-3β失活进而调节mPTP的开放发挥心肌保护作用，mKATP可能未参与此过程[25]。白藜芦醇可能通过Zn2+使GSK-3β失活进而调节mPTP开放发挥心肌保护作用，且AKT可能未参与此过程[26]。

2.3 Zn2+与线粒体 有研究显示，Zn2+结合蛋白能够抑制线粒体内电子的传递，诱导线粒体ROS的生成[27]。在线粒体基质中，高浓度的Zn2+能够抑制还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADH）的生成从而抑制线粒体能量代谢和三羧酸循环[28]。在线粒体诱导的凋亡中，Zn2+能够增强Bax表达，增大Bax/Bcl-2的比值，从而加强线粒体相关的凋亡效应。目前，关于Zn2+与线粒体直接联系的相关报道较少，有待进一步研究探讨。

3 内质网保护机制

内质网是真核细胞重要的细胞器，它是由封闭膜系统以及互相沟通的膜腔而形成的网状结构，其生理功能包括蛋白质的折叠与生成、固醇类的生成和代谢以及钙水平的调节等[29-30]。当细胞受到损伤发生应激时，将会导致蛋白的合成受到抑制、不正确折叠蛋白的堆积和未折叠蛋白的激活，即未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。UPR会进一步破坏内质网的稳态并发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）[31]。外部环境对细胞产生刺激，诱导细胞发生UPR反应，在早期能够促进恢复内质网稳态，减轻对细胞的损伤。但是持续的UPR反应将会促进细胞凋亡[32]。葡萄糖调节蛋白（glucose regulated protein,GRP）78、94是两个经典的内质网分子伴侣，尤其GRP78（BiP）是UPR通路的中心操纵子[33]。

3.1 内质网与线粒体机制 ERS已经被证实参与到心肌缺血再灌注损伤的发病机理中[34]。研究显示，在糖尿病心脏中ERS损伤时，促红细胞生成素能够使GSK-3β失活进而阻止mPTP开放来保护心肌[35]。在大鼠心肌缺血再灌注模型中，再灌注使GRP78表达明显增加，而ERS抑制剂TUDCA能够明显降低再灌注GRP78表达并有效减少梗死面积，更加印证ERS在心肌缺血再灌注损伤中扮演着重要角色[36]。ERS可能通过Akt/GSK-3β信号通路来调节mPTP的开放从而减弱心肌收缩力[37]。mPTP开放抑制剂cyclosporin A或者GSK-3β抑制剂SB216763能够抑制ERS诱导的心肌细胞和线粒体异常[37]，进一步证实ERS造成心脏损伤可能是通过GSK-3β通路来调节mPTP开放来实现[35]。因此，内质网和线粒体之间联系紧密，阐明“内质网-线粒体对话”机制对于治疗心肌缺血再灌注损伤可能具有非常重要的作用。

3.2 内质网与Zn2+内质网是细胞内Zn2+的贮藏所，外界因素的刺激能够促进Zn2+从内质网中释放[38]。与此同时，Zn2+同样能够维持内质网的正常功能[39]。近期的研究表明，Zn2+缺乏可能会导致内质网应激[40]。在不同的实验模型中，Zn2+能够保护心肌防止缺血再灌注损伤[41]。内质网应激抑制剂TUDCA能够使细胞内游离的Zn2+浓度增加，具有模拟外源性Zn2+的作用[42]。我们课题组研究结果显示，TUDCA明显减少再灌注期GRP78的表达，这种作用被TPEN所抑制；TUDCA明显减少梗死面积，这种作用被mPTP开放剂atrctyloside所逆转，表明抑制ERS可能通过调节mPTP的开放来实现，Zn2+可能介导心肌保护的“内质网-线粒体对话”机制[36]。

3.3 IRE1通路与Zn2+内质网应激反应中，肌醇需酶1（inositol-requiring enzyme 1,IRE1）、蛋白激酶样ER激酶（PKR-like ER kinase,PERK）、活化转录因子 6（activating transcription factor 6,ATF 6）能够调节基因表达和蛋白质翻译，是UPR的核心信号转导分子[43]。其中IRE1蛋白进化上高度保守，从酵母到高等脊椎动物都有表达，是UPR过程中最重要的通路[44]。研究显示，正常生理情况下，这些信号转导分子在内质网膜上与GRP78以非共价键的形式绑定且并不活化。当发生ERS时，内质网膜上的IRE1是最早被发现的做出反应的跨膜蛋白，能够与GRP78解离，使得IRE1激活[45]。IRE1能够直接与未折叠蛋白结合，其与GRP78结合的位点突变后也同样能开启UPR。因此，IRE1与GRP78的解离并非是激活IRE1的开关，而是一个伴随事件[46]，IRE1活性是决定UPR持续时间的关键因素[47]。因此，IRE1的激活能够缩短UPR持续时间，降低ERS造成的损害，保护缺血再灌注损伤的心脏。

Zn2+缺乏导致内质网损伤主要通过两种方式：一是扰乱了脂膜的内稳态，能够激活突变型IRE1转变为一个水平类似的野生型IRE1；二是Zn2+缺乏扰乱内质网蛋白的折叠，激活野生型IRE1而不是突变型IRE1[48]。综上所述，Zn2+可能通过IRE1参与心肌“内质网-线粒体对话”，但其详细细胞信号转导机制尚不清楚，有待进一步研究与探索。

4 展望

综上所述，IRE1参与维护内质网稳态，抑制ERS，但其与Zn2+之间关联性尚未清楚。不过IRE1参与心肌保护是明确的，对于急性心肌梗死患者可能存在治疗作用。关于IRE1参与心肌保护作用的具体机制尚需要进一步研究。线粒体-锌离子-内质网之间联系密切，研究成果也较为显著，但ERS通路的下游蛋白IRE1与Zn2+、线粒体之间关联性的研究较少，阐明其在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制是亟待解决的问题。