酸性调宁蛋白的研究进展

雷 蕾，刀 庆，牛成慧，韩雁冰

(昆明医科大学第一附属医院神经内科，昆明 650032)

调宁蛋白(calponin)是一种表达于平滑肌细胞及非肌细胞(神经元、成纤维细胞、人绒毛膜癌细胞等)中的调节蛋白，它们能与肌动蛋白结合，抑制由肌动蛋白激活的肌球蛋白ATP酶的活性，是一个分子量在34 × 103～ 37 × 103(292 ～ 330个氨基酸)的肌动蛋白家族。

1 调宁蛋白概述

Calponin最早发现于鸡砂囊平滑肌组织中，参与平滑肌的收缩调节[1]。在早期对蛋白结合作用的研究中发现，calponin能与肌动蛋白(actin)[2]、交联蛋白(cross-links actin)[3]、钙调蛋白(calmodulin)[4]、原肌球蛋白(tropomyosin)[5]、肌球蛋白(myosin)[6]、结蛋白(desmin)[7]、微管蛋白(tubulin)[8]、钙调素结合蛋白(caldesmon)[9]、凝溶胶蛋白(gelsolin)[10]结合，参与细胞增殖、细胞骨架维持等多种功能调节。

目前在脊椎动物中，已分离出calponin的三种异构体。根据其等电点(isoelectric point，pI)的不同，分为碱性调宁蛋白(h1-calponin，pI=9.4)、中性调宁蛋白(h2-calponin，pI=7.5)、酸性调宁蛋白(h3-calponin，pI=5.2)[11]。通过在多种物种中对这三种calponin异构体cDNA测序发现，h2-calponin和h3-calponin的前273个氨基酸残基与h1-calponin高度相似，但其羧基末端序列有较大的差异，从而导致三种异构体不同的分子量大小和电荷[12-13]。这三种异构体是其三种同源基因的产物。在人类基因组里，编码h1-calponin的CNN1基因位于染色体19p13.2-p13.1[14]，编码h2-calponin的CNN2基因位于19p13.3[15]，编码h3-calponin的CNN3基因位于1p22-p21[16]。这三种基因亚型表现出不同的组织及细胞特性。H1-calponin主要表达于终末分化和非增殖性的平滑肌细胞中，参与平滑肌的收缩调控[17]。H2-calponin在组织中则有更为广泛的分布，包括平滑肌细胞、表皮角质细胞[18]、成纤维细胞[19]、肺泡细胞、内皮细胞[20]、髓系白细胞[21]。H3-calponin在平滑肌细胞及非肌细胞中均有发现，被认为在神经元重塑中参与肌动蛋白的调节[22]。

2 酸性调宁蛋白的分子生物学特点

H3-calponin最初发现于大鼠主动脉血管平滑肌中，该蛋白前273个氨基酸残基与h1-calponin具有高度同源性，但在羧基末端的剩余57个残基组成了一个特殊的强酸性质的结构域，与纤维状肌动蛋白(filamentous actin，F-actin)结合，受钙离子和钙调蛋白的调节[23]。体外实验研究发现，h3-calponin和h1-calponin与F-actin竞争性结合。H3-calponin与F-actin之间亲和力较高，两者的解离常数Kd值为：1.6 × 105(mol/L)-1，具有浓度依赖性，当h3-calponin与肌动蛋白分子摩尔比值为1∶1～1∶2时，两种蛋白的结合趋于饱和。与h1-calponin能与多种蛋白结合的特性不同，虽然h3-calponin与F-actin有结合位点，但与结蛋白、原肌球蛋白、钙调蛋白、S100(一种钙结合蛋白)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)囊泡没有较高亲和力，且h3-calponin对肌动球蛋白Mg2+-ATP酶的活性抑制没有明显作用，这提示h3-calponin与h1-calponin的生化功能有差异。为探究其耐热性，将h3-calponin加热至95℃后置于0℃冰浴中3 min，再在70 000 r/min转速下离心10 min后，80%的蛋白聚集成颗粒状变性失活，表明h3-calponin不具有热稳定性[24]。H3-calponin独特的分子生物学特点决定了其独有的生物学作用。

3 酸性调宁蛋白的生物学作用

自上世纪80年代calponin被发现以来，对其研究涉及各类细胞组织，但h3-calponin作为调宁蛋白家族中的一员，迄今是研究最少的。随着对h3-calponin研究的深入，对该蛋白生物学作用有更进一步认识。

3.1 酸性调宁蛋白参与树突棘重塑

H3-calponin在多种细胞组织中均有分布，但主要分布于脑组织中。Trabelsiterzidis等[25]通过免疫印迹和免疫荧光定位分别在猪、大鼠脑组织和大鼠小脑组织中分别发现分子量约为36 × 103～ 37 × 103和35 × 103～ 36 × 103的调宁蛋白样蛋白表达，使用等电聚焦的方法，证实与Applegate等[23]报道的蛋白一致，表明h3-calponin在脑组织中也有表达。H3-calponin集中于神经元轴突的生长锥、成熟小脑及皮质细胞的膜下区域，并且在体内神经胶质细胞，如放射状胶质细胞，胶质界膜，Bergmann胶质细胞，成熟的星形胶质细胞中也富集[26]。在海马超微结构研究中发现，h3-calponin存在于对称性(抑制性GABA能受体)突触的突触后膜，并聚集于非对称性(兴奋性谷氨酸能受体)突触的突触后致密物(post-synaptic density，PSD)中。此外，h3-calponin沿着树突棘的微管分布，并与之连接，而这些微管参与树突棘形状和大小的改变，提示h3-calponin可能在树突棘重塑过程中发挥作用[27]。

在氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型中，谷氨酸能神经网络发生重组，表现为颗粒细胞轴突的异常出芽，新生突触形成，树突棘重塑。Ferhat等[28]在此模型中发现，当大鼠呈癫痫持续状态时，海马齿状回颗粒细胞的树突大量减少，3 d后其树突棘开始再生，并在15 d后达到稳定。树突棘的再生可能是由原有颗粒细胞中新的树突棘形成和/或癫痫诱导下新生颗粒细胞树突棘发育而成。该团队发现h3-calponin的表达水平是在树突棘密度增加的时期上升，猜测h3-calponin参与新的树突棘形成。而在癫痫急性期，h3-calponin的表达水平在树突棘内有迅速的升高，并且其升高发生在树突棘形态及齿状颗粒细胞密度的重塑过程中，表明h3-calponin参与树突棘的重塑。在随后研究中，Rami等[22]发现在体外培养的海马神经元中，h3-calponin不仅存在于树突棘中，也存在于树突轴中，并且过表达的h3-calponin通过调整肌动蛋白细胞骨架的重组和动力学改变，来调节树突棘的形态学以及密度，使树突棘棘突延长，树突棘密度增加。

物理因素刺激下，h3-calponin的表达水平也会发生变化。在声波振动(40 Hz)的干预下，过表达的h3-calponin，通过调节离子型谷氨酸受体，使钙离子浓度上升，最终诱导树突棘的重塑发生[29]。

3.2 酸性调宁蛋白参与细胞骨架重组

H3-calponin通过调节肌动蛋白细胞骨架重组，影响细胞增殖、粘附、迁移、分化、吞噬和融合。Calponin中的CLR(calponin-like repeat)三拷贝串联重复序列构成了两个独立的肌动蛋白结合位点(actin-binding site，ABS)。其中，ABS1能在体外与F-actin结合，ABS2能与不含双CH结构域形成的F-actin结合域(F-actin-binding domain，ABD)的蛋白质相结合。Calponin能与肌动蛋白细胞骨架相结合基于ABS1、ABS2和羧基末端序列的特性。H3-calponin主要与F-actin相互作用抑制肌动蛋白在肌球蛋白上滑动，从而调节细胞骨架重组。Shibukawa等[30]发现在滋养层细胞融合过程中，h3-calponin羧基末端的S293/296位点发生磷酸化，触发h3-calponin羧基末端的磷酸化，高度磷酸化的h3-calponin促进肌动球蛋白的收缩，促使细胞骨架重组。此外，h3-calponin作为μ-钙蛋白酶(μ-calpain)水解产物，能被μ-calpain水解，提示h3-calponin参与由μ-calpain调节的肌动蛋白细胞骨架的重组过程[31]。

3.3 酸性调宁蛋白参与平滑肌细胞收缩调控

在平滑肌细胞中，肌动蛋白纤维组成的微丝参与肌肉的收缩[32]。Daimon等[33]在皮肤伤口愈合过程中发现，成纤维细胞增殖分化为肌成纤维细胞，h3-calponin在此类细胞增殖期表达，并参与α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)形成应力纤维。该团队同时利用慢病毒转染，使成纤维细胞细胞中CNN3基因下调，结果发现CNN3基因缺陷的成纤维细胞不能形成强有力的应力纤维，从反面验证h3-calponin在肌动蛋白纤维的形成过程中发挥作用。

3.4 酸性调宁蛋白参与骨骼肌发育调节

H3-calponin在骨骼肌发育中起重要作用。Liang等[34]基于对猪骨骼肌中microRNA和mRNA配对分析发现，CNN3基因受miR-1的调控。进一步通过实时定量PCR(real-time PCR)证实在骨骼肌发育过程中，h3-calponin在mRNA上的表达水平与miR-1呈显著的负相关。这些结果表明，h3-calponin参与骨骼肌发育调节，并且CNN3是与生长发育相关联的基因。

3.5 酸性调宁蛋白参与胎盘形成与胚胎发育

细胞融合对胎盘发育和成熟至关重要。蛋白组学研究显示h3-calponin在人和小鼠胎盘组织中均有表达，并调节胎盘中滋养层细胞融合。在下调CNN3基因表达后，反而促发肌动蛋白细胞骨架重组和合胞体的形成，提示h3-calponin在滋养层细胞融合过程中起负性调节的作用[30]。在人类胎盘形成过程中，胎儿的滋养层细胞分化为侵袭型和非侵袭型，h3-calponin在低氧条件下，通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)诱导滋养层细胞发生侵袭[35]。Flemming等[36]通过运用基因靶向技术分别敲除小鼠CNN1、CNN2、CNN3基因，发现敲除了CNN3基因的小鼠由于中枢神经系统发育缺陷在胚胎期和新生期即出现很高的死亡率，表明h3-calponin在胚胎形成期起关键性作用。

3.6 酸性调宁蛋白参与细胞信号转导

细胞信号转导是指，通过细胞膜或细胞内的受体在细胞通过时感受到信息分子的刺激，由细胞内信号转导系统转换，从而影响细胞生物学功能的过程。在成纤维细胞迁移过程中，h3-calponin通过调节细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)介导的l-钙调素结合蛋白的磷酸化，参与其迁移过程[37-38]。MEKK1是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路中的重要成员，MEKK1介导的h3-calponin发生磷酸化，增加细胞外基质的粘附性及细胞表明张力，增强细胞的收缩力[39]。

4 酸性调宁蛋白的临床应用

H3-calponin的表达变化与多种疾病的发生进展相关，可辅助临床上多种疾病的诊断及其预后的判断。Han等[40]通过基因芯片扫描发现，耐药性癫痫患者脑内的CNN3基因的表达明显上调。对耐药性癫痫患者脑组织以及颞叶癫痫大鼠脑组织中的h3-calponin进行检测，其表达水平较正常组有明显的升高，提示h3-calponin在脑内的表达与癫痫活动程度密切相关。该团队同时对不同发作程度癫痫患者脑脊液中h3-calponin进行检测发现，反复癫痫发作患者的脑脊液中，h3-calponin的表达水平明显升高，提示脑脊液中的h3-calponin水平能够作为一种潜在的与癫痫发作相关的生物标记物，并利于癫痫和耐药性癫痫的鉴别诊断。Nakarai等[41]在大肠癌患者术后组织标本中检测到h3-calponin的表达上调显著，并且更具有特异性和稳定性，认为h3-calponin的表达水平可作为大肠癌淋巴结转移的检测指标，可作为大肠癌淋巴结早期转移的诊断标志。在对CNN3基因与疾病关系的检测中发现，黏膜相关淋巴组织淋巴瘤中CNN3基因发生重排[42]，而在卵巢癌中，CNN3的表达与该疾病进程相关[43]。虽然需要进一步的研究以明确CNN3的有效性，但以CNN3为诊断或治疗靶点的临床方法具有很大实施潜力。

5 小结及展望

自calponin发现以来已有三十余年，作为肌动蛋白相关调节蛋白，它在参与平滑肌收缩和非肌细胞活动方面被研究的颇为广泛。H3-calponin虽是calponin家族最“年轻”的成员，但随着对h3-calponin的进一步认识发现，它不仅仅在调控神经元可塑性中起主要作用。对这三种基因的起源研究显示CNN3相对于另外两种基因更古老，提示h3-calponin可能更能代表calponin蛋白的本质，值得未来更深入的研究。