膀胱癌的超声分子影像学研究进展

刘敏薇，徐盼，周爱云

南昌大学第一附属医院超声科，江西南昌 330006；

膀胱癌是常见的泌尿系统肿瘤之一，在世界范围内居常见肿瘤发病率第9位，病死率居第13位[1]，根据浸润深度，70%的膀胱癌为非肌层浸润性膀胱癌，包括原位癌、Ta、T1期膀胱癌；30%为肌层浸润性膀胱癌，包括T2～4期膀胱癌[2-3]。尽管非肌层浸润性膀胱癌不易发生远处转移，但90%的非肌层浸润性膀胱癌患者手术后仍会复发，且25%的非肌层浸润性膀胱癌会进展为肌层浸润性膀胱癌[4]，故仍需要密切行实验室检查及影像学检查监测患者的病情变化。超声分子影像学是目前医学影像学研究的热点之一，能够无创、实时、早期诊断、动态观察病灶变化等，可以用于早期诊断、评估病情和特异性治疗等。超声分子影像的发展对膀胱癌的诊断、病情监测和治疗具有重要临床意义。

1 膀胱癌的诊断及治疗

膀胱镜检查是目前临床上用于诊断膀胱癌的技术，包括白光、窄谱及荧光膀胱镜检查等。然而，白光膀胱镜容易忽略扁平的高分化肿瘤（如原位癌），难以辨别肿瘤的良恶性[5]。窄谱膀胱镜是在普通内镜光源处应用特殊的光学滤镜滤掉红光，将光源的波长限制在415～540 nm，增强蓝光和绿光的强度，从而提高对膀胱富血管肿瘤组织的显像[6]。窄谱膀胱镜比传统膀胱镜能清晰地显示肿瘤边缘，使得肿瘤更容易切除，但其检测假阳性率较高。荧光膀胱镜又称为蓝光膀胱镜，是利用光敏剂使肿瘤组织选择性吸收，在蓝光（波长380～480 nm）的激光照射下，光敏剂发生一系列光化学反应和光生物学反应，发射出红色的荧光，从而在蓝色背景下区别正常组织和肿瘤组织[7]。荧光成像对浅表组织具有高灵敏度，但其空间分辨率低、组织穿透性差，且目前大多数荧光示踪剂缺少分子特异性。尿液细胞学化学筛检是膀胱肿瘤诊断的“金标准”之一，但尿液检查易受尿路因素的影响，误诊率高。

经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBt）是治疗浅表性膀胱癌（非肌层浸润性膀胱癌）的“金标准”，而肌层浸润性膀胱癌较常见的治疗方法包括膀胱根治性切除术、新辅助化疗和放化疗[3]。根治性切除术会给患者带来不可逆的损伤，因此国际上部分医疗机构推荐使用化疗和放疗或联合疗法，既可以保存膀胱，也为无法行手术治疗的患者提供了一种可选择的治疗手段[8]。此外，为了防止肿瘤复发，术后常联合吡柔比星、丝裂霉素、阿霉素、舒尼替尼、卡介苗等对膀胱癌患者进行膀胱灌注治疗。膀胱灌注治疗是膀胱癌治疗的一大特点，它可使药物易于与病灶直接接触，尤其是对浅表性膀胱癌有较好的治疗效果。随着灌注药物，特别是靶向药物的深入研究，超声分子影像学在膀胱癌诊断及治疗中的运用也得到越来越多的关注。

2 超声分子影像

分子影像学是传统影像学与分子学相融合的交叉学科，通过传统影像学方法对细胞水平或分子水平的生物过程进行定量或定性分析，可以直接、间接记录和观察在发生生物事件时，细胞及分子在空间和时间上的分布情况[9]。超声分子影像学以靶向超声造影剂为探针，具有以下功能：①能够在分子水平无创性地显示炎症、血栓、肿瘤的血管形成；②可将基因表达、生物信号传递等复杂的过程变成直观的图像；③使临床更好地在分子水平了解疾病的发生机制及特征；④能够发现疾病早期的分子变异及病理改变过程；⑤可在活体连续观察药物或基因治疗的机制、效果等。目前新型的靶向超声造影剂包括纳米级超声造影剂、多模态超声造影剂、相变超声造影剂等。关于分子靶向超声造影剂的应用，既往研究证实其在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等的诊断中均有重要作用[8,10-11]。Willmann等[12]首次将血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）靶向造影剂BR55运用于21例乳腺癌患者及24例卵巢癌患者，获得卵巢癌及乳腺癌患者病灶的KDR（VEGFR-2）表达情况，并将病灶免疫组化染色所得 KDR表达作为“金标准”与血管靶向造影剂BR55获得的表达水平进行比较，结果表明，乳腺癌患者靶向造影剂获得的KDR表达水平与其病理免疫组化结果吻合度为93%，卵巢癌患者中两者吻合度为85%，研究监测患者血压、心电图、心率等均未出现异常，证明该靶向造影剂安全、可行。从动物实验到第一次运用于人体病灶，该实验结果表明超声分子影像学将是一个辨别良恶性病灶的理想检查方法，能够减少一些不必要的组织活检及手术。

3 超声分子影像在膀胱癌中的应用

3.1 血管生成相关标志物靶向造影剂在膀胱癌诊断及治疗中的运用 新生血管是肿瘤获得血液供应的唯一途径，其与肿瘤的生长、转移及预后密切相关[13]。肿瘤新生血管是反映肿瘤分级、侵袭性及预后的重要标准。而肿瘤组织的微血管密度水平与其大小、是否形成癌栓及与肿瘤复发、转移等密切相关。免疫组化是目前测量肿瘤微血管密度的常用方法，但通过该方法测得的数据仅能提供一个时间点的肿瘤组织微血管密度水平，并非实时、动态。前期研究通过免疫组化分别测得高级别膀胱尿路上皮癌患者与低级别膀胱尿路上皮癌患者肿瘤组织的微血管密度，发现膀胱癌病理级别越高，微血管密度越大[14]，提示膀胱肿瘤生长、转移均与新生血管有关。大量的蛋白质和酶均参与了肿瘤新生血管的信号转导通路，如VEGFR-2、整合素avβ3、P-选择素、血管细胞黏附因子-1（VCAM-1）等。Coskun等[15]研究发现，膀胱癌患者血清中P-选择素、可溶性血管细胞黏附因子-1（s-VCAM-1）及可溶性细胞间黏附因子-1水平显著高于正常人，且肌肉浸润性膀胱癌患者血清s-VCAM-1水平高于浅表性膀胱癌患者，提示在膀胱癌患者中，参与新生血管信号转导通路的P-选择素、VCAM-1等表达水平升高。Chan等[16]将生物素化的抗 VEGFR-2单克隆抗体与声学性能良好的微泡结合形成血管靶向造影剂，将造影剂由眶后静脉注入原位膀胱癌的小鼠模型体内，然后运用数字减影技术依次测得注入造影剂前后的超声图像强度，以及低频脉冲波爆破造影剂前后超声图像强度，通过计算各图像强度的改变量化小鼠膀胱癌血管表面 VEGFR-2的表达情况（即以爆破靶向造影剂前后超声图像强度差值代表VEGFR-2的表达）。实验结果表明，在小鼠肿瘤种植第 14天和第 21天，代表VEGFR-2表达水平的平均图像信号强度由 7.15±7.51上升至32.95±21.01，其图像强度改变差异有统计学意义（P=0.006），表明随着肿瘤生长，其VEGFR-2表达水平升高，提示血管靶向造影剂能与膀胱肿瘤有效结合，为实现实时准确地监测膀胱癌的微血管变化奠定了理论基础。高渝等[17]利用超声微泡造影剂介导血管内皮生长因子反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）转染作用于人膀胱癌裸鼠移植瘤模型（即UM+ASODN组），与注射微泡造影剂（UM组）及生理盐水（单纯组）对照，发现UM+ASODN组抑瘤率为67.22%，与对照组抑瘤率比较，差异有统计学意义（P＜0.01），其实验结果证明微泡介导的 VEGF反义寡核苷酸转染能有效抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生长，表明抑制膀胱癌组织中血管生长因子的表达能抑制肿瘤新生血管生成，进而有效抑制膀胱肿瘤的生长，是评价抗血管生成药物对肿瘤的疗效提供直接、无创的潜在检测及治疗技术。

3.2 肿瘤导向肽靶向造影剂及其载药后运用于膀胱癌细胞及活体实验的研究 目前大多数抗肿瘤药物无靶向性，容易引起患者全身毒性反应和不良副作用。大量研究拟寻找能够与肿瘤细胞或肿瘤血管特异性结合的相关肽段，引起学者对肿瘤导向肽的关注[18]。目前已确认的膀胱癌导向肽包括多肽序列（CSNRDARRC）、NYZL1及PLZ4。Smith[19]于1985年报道了外源多肽在单链噬菌体表面呈现的结果，噬菌体展示文库技术随之在国内发展起来。Lee等[20]利用噬菌体展示文库技术首次成功筛选提取到特异性高度结合膀胱肿瘤HT-1376细胞株的小分子多肽序列（CSNRDARRC）；随后，罗俊西等[21]采用体内噬菌体展示技术筛选得到人膀胱癌 BIU87的特异性靶向多肽标志物（CSSPIGRHC），并命名为NYZL1。随着纳米微泡制作技术及膀胱肿瘤导向肽的研究日益成熟，苏西西等[22]利用机械振动法制备普通脂性纳米微泡，用生物素-亲和素桥接法将生物素-分子导向肽 NYZL1连接到纳米微泡表面，制备出具有靶向特异性结合的膀胱癌BIU-87癌细胞的新型造影剂，通过体外超声影像设备发现该靶向造影剂能够在体外与膀胱癌 BIU-87细胞特异性结合。潘佐[23]也得出同样结论，且进一步将脂性微泡与标记了荧光探针的 NYZL1导向肽结合运用于裸鼠实验，通过活体荧光分子成像仪观察到靶向微泡能与膀胱异体种植的肿瘤特异性结合，为未来的膀胱癌早期诊断提供了理论依据。Zhang等[24]采用一株一肽法制备了膀胱癌导向肽PLZ4，并证明其能与5种来源于人类患者原发性膀胱癌细胞结合，尤其与人膀胱癌细胞系 5637结合能力最强，而不与正常的尿路上皮细胞结合。同时，该研究收集正在接受卡介苗灌注治疗患者的尿液，在pH为6的尿液环境中，发现PLZ4能与尿液中的膀胱癌细胞结合而不与尿液中的非肿瘤细胞结合。Pan等[25]将膀胱癌导向肽PLZ4与纳米聚合物胶体束结合并通过蒸发法将抗肿瘤药物紫杉醇载入纳米胶体束核心，称为DC-PNM-PTX。该研究发现，DC-PNM-PTX能够稳定地存在于十二烷基磺酸钠中，易溶解于加有谷胱甘肽的溶液。通过静脉给药，发现 DC-PNM-PTX能够特异性地结合来源于人类膀胱肿瘤细胞异体种植于裸鼠的膀胱肿瘤，而不与异体种植的肺部肿瘤结合。同时实验证明通过DCPNM-PTX给药能将种植膀胱癌的裸鼠生存天数从非靶向给药生存的55 d延长至69.5 d。Lin等[26]将PLZ4运用于膀胱癌的光动力学诊断及治疗，将光敏剂鲍光过敏素结合纳米胶体束，又将PLZ4与纳米胶体束结合，再将两者结合使其形成具有靶向功能及光动力学诊断/治疗的纳米级光学造影剂（PNPs），将其放入混有来自人体的膀胱癌细胞系 5637与正常的尿路上皮细胞的培养皿中，发现 PNPs能与人膀胱癌细胞系5637特异性结合，与正常的尿路上皮细胞不结合。同样，该研究还将纳米胶束与阿霉素结合，形成 PNPDOX，发现其药效释放较普通阿霉素更持久。导向肽作为特异性结合膀胱肿瘤的标志物，其分子量小于抗体，因而不易引起人体的免疫排斥反应，更易进入肿瘤组织，使其结合的药物药效更持久，且患者耐受性好[27]，而且肿瘤导向肽通过科技技术自动合成，价格更加实惠，为日后成为临床常用的诊断及治疗手段提供可能。

综上所述，膀胱尿路上皮相关特异性表达的标志物还包括尿路上皮特异蛋白II、S蛋白100P等[28-29]，未来将有潜力运用于膀胱癌靶向造影剂的研究。血管靶向造影剂BR55作为临床实验的新药已经获得了美国食品和药物管理局的批准，将运用于下一步临床试验。导向肽介导的靶向纳米微泡能特异性地结合膀胱肿瘤，而几乎不与其他肿瘤或器官结合，使膀胱癌的诊断及治疗真正达到“专一”的靶向效果，其分子量小，结合力强，不易被体内的吞噬系统清除，这使得导向肽有可能成为未来膀胱癌精准诊疗的重要小分子载体。超声分子影像学的优势在于利用膀胱癌相关的标志物示踪，提高早期诊断率、提供病情发展动态情况、降低非靶向治疗中带来的副作用及不良毒性反应等。随着超声分子影像学的快速发展，膀胱癌的早期诊断、精准治疗也将不断提高。