黄酒氨基酸态氮含量测定结果的不确定度评定

赵宇明

（大连市食品检验所，辽宁大连116630）

滴定分析是化学分析测量中最基本和最常用的分析方法。典型的以滴定分析为基础、以酸度计指示滴定终点的滴定分析方法是测量试样中氨基酸态氮含量的常用方法。测量不确定度是评价测量水平的指标，也是判定测定结果可靠性的依据[1]。测量不确定度是指测量结果变化的不稳定，是表征被测量的真值在某个量值范围的一个估计，是测量结果含有的一个参数，用以表示被测量值的分散性。测量不确定度是对测量结果质量的定量表征,测量结果的可用性在很大程度上取决于其不确定度的大小。不确定度越小,测量结果质量越高,测量水平越高,其使用价值也越高。反之，不确定度越大,测量结果质量越差,测量水平越低,其使用价值也越小。因此,测量结果表述必须同时包含赋予测量的值及与该值相关的测量不确定度,才是完整并有意义的。这样既便于使用其测量结果的人评定其可靠性,又可以增强测量结果的可比性。对黄酒产品中各指标的不确定度评定较少[2-6]，黄酒中氨基酸态氮含量测定的不确定度评定未见报道。依据国标GB/T 13662—2008[7]测定黄酒氨基酸态氮的分析方法以及JJF 1059.1—2012[8]的要求对黄酒中氨基酸态氮的测定结果的不确定度进行了分析和评定，为同类测量结果不确定度的评定提供一种思路。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

BSA3202S型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；雷磁JB-1A型电磁搅拌器，附磁力搅拌棒，上海仪电科学仪器股份有限公司；PP-15型酸度计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；DK-98-II型电子调温万用电炉，天津市泰斯特仪器有限公司；实验室常用玻璃仪器。邻苯二甲酸氢钾，工作基准试剂（纯度99.95%），中国计量科学研究院提供。

氢氧化钠、酚酞指示剂、甲醛为分析纯试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司生产。实验室用水为二次蒸馏水。

1.2 分析测试

按国标GB/T 601—2002[9]要求，用烘干至恒重的工作基准试剂邻苯二甲酸氢钾对已经配制好的氢氧化钠溶液进行标定。黄酒试样溶液配制和测定，按国标GB/T 13662—2008执行，具体操作为：吸取黄酒试样10.0 mL于150 mL烧杯中，加入无二氧化碳的水50 mL。烧杯中加入磁力搅拌棒，置于电磁搅拌器上，开启搅拌，用氢氧化钠标准滴定溶液（0.1 mol/L）滴定，开始时可快速滴加氢氧化钠标准滴定溶液，当滴定至pH7.0时，放慢滴定速度，每次加半滴氢氧化钠标准滴定溶液，直至pH8.20为终点。记录消耗0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积。加入甲醛溶液10.0 mL，继续用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH9.20，记录加甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（V1）。同时做空白试验，分别记录不加甲醛溶液及加入甲醛溶液时，空白试验所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（V01、V0）。

1.3 环境条件

分析测试的最适宜条件为：环境温度控制在20～25℃，相对湿度控制在50%～70%。

2 测量不确定度来源的识别

2.1 数学模型的建立

国标GB/T 601—2002化学试剂标准滴定溶液的制备中氢氧化钠标准滴定溶液浓度的计算公式为：

式中：X——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；

V1——测定试样时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

V0——空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

m——邻苯二甲酸氢钾的质量的准确数值，g；

M——邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量，g/mol；

1000——单位换算系数。

国标GB/T 13662—2008黄酒中氨基酸态氮公式为：

式中：X——试样中氨基酸态氮的含量，g/L；

V1——加甲醛后，测定试样时消耗0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

V0——加甲醛后，空白试验时消耗0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

c——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；

V——吸取试样的体积，mL；

0.014——氮的摩尔质量，g/mol；

1000——单位换算系数。

结合式（1）和式（2）进行数学模型的建立，对模型进行分析，确定黄酒中氨基酸态氮含量的测定不确定度来源的主要影响参数。

2.2 不确定度来源的识别

从分析测试过程及检测模型中，可以确定黄酒中氨基酸态氮含量的测定不确定度来源的主要影响参数，见图1。

黄酒中氨基酸态氮测定不确定度主要来源有：①试样的重复性测定引入的不确定度；②氢氧化钠标准滴定溶液的浓度引入的不确定度；③滴定黄酒实际消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积引入的不确定度；④吸取黄酒试样时试样体积引入的不确定度；⑤酸度计示值指示误差引入的不确定度。其中①是由于重复性测试所导致,来源于单一测定重复性标准偏差，采用A类方法评定。除此之外，由系统效应导致的不确定度，包括②—⑤，采用B类方法评定。

3 计算测量相对标准不确定度

3.1 试样重复性测定引入的相对标准不确定度

黄酒试样中氨基酸态氮的测量结果见表1，则试样重复性测定引入的相对标准不确定度(u1rel)为：

图1 不确定来源及因果关系

表1 黄酒试样中氨基酸态氮的测量结果(n=6)

3.2 氢氧化钠标准滴定溶液的浓度引入的不确定度

根据图1和公式（1）可知，氢氧化钠标准滴定溶液的浓度引入的不确定度的主要影响参数有重复性(rep)、基准物质邻苯二甲酸氢钾的质量(mKHP)、基准物质邻苯二甲酸氢钾的纯度(PKHP)、滴定基准物质邻苯二甲酸氢钾所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积(VT1)、基准物质邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量(MKHP)。

3.2.1 重复性标定氢氧化钠标准滴定溶液浓度引入的相对标准不确定度

标定氢氧化钠标准滴定溶液6次，浓度的结果见表2。则试样重复性测定引入的相对标准不确定度(urep)为：

表2 氢氧化钠标准滴定溶液的标定结果(n=6)

3.2.2 基准物质邻苯二甲酸氢钾的质量引入的不确定度

基准物质邻苯二甲酸氢钾的质量由天平称量而来，那么天平带来的不确定度主要来源于两部分：（1）天平校准：天平制造商给出了天平的置信区间为±0.15 mg，该数值代表了托盘上被称量的实际质量与从天平所读取的数值的最大差值，服从矩形分布，可得：

（2）称量变动性（即称量重复性）：由天平称量KHP质量为mKHP=0.7607 g(差量法)。根据历史记录，在50 g以内，变动性标准偏差为0.05 mg，则有：

u2(mKHP)=0.05 mg。

所以天平称量的u(mKHP)在称量时应重复计算2次，分别为总质量和剩余质量的计算，所以应计算2次不确定度，则：

3.2.3 基准物质邻苯二甲酸氢钾的纯度引入的不确定度

由基准物质邻苯二甲酸氢钾的供应商证书得知，邻苯二甲酸氢钾的纯度PKHP=99.95%±0.05%，假定其纯度的不确定度按矩形分布，则标准不确定度为：

3.2.4 滴定基准物质邻苯二甲酸氢钾所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积(VT1)引入的不确定度

滴定基准物质邻苯二甲酸氢钾所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积(VT1)的不确定度来源于6个部分：（1）滴定管体积校准带来的不确定度；（2）充满液体至滴定管刻度变动性（滴定体积的重复性）引入的不确定度；（3）滴定管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度；（4）人员读数所带来的不确定度；（5）终点检测的重复性，它独立于滴定体积的重复性；（6）由于滴定过程中吸入CO2以及由滴定曲线计算终点不准确，滴定终点与化学计量点之间可能存在系统误差等。由于在滴定过程中，滴定的终点可以由自动滴定装置判断，在该装置中装有测定pH曲线形状的组合pH电极，则终点检测的重复性可忽略。另外滴定若在氮气的氛围下进行，即可避免滴定时CO2所带来的误差；又由于是强酸滴定强碱，滴定终点与化学计量点一致，所以终点偏差及其不确定度可以忽略不计。这样，滴定基准物质邻苯二甲酸氢钾所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积(VT1)的不确定度主要来源确定为4个部分，即（1）—（4）。

3.2.4.1 滴定管体积校准带来的不确定度

制造商给出滴定管体积的置信区间为±0.03 mL，则假设按照矩形分布，滴定管体积校准引起的不确定度为：

3.2.4.2 充满液体至滴定管刻度变动性（滴定体积的重复性）引入的不确定度

根据CNAS-GL06：2006《化学分析中不确定度的评估指南》[10]中给出了经验典型值，滴定管的变动性标准偏差为0.0092 mL，则充满液体至滴定管刻度变动性（滴定体积的重复性）引入的不确定度为：

3.2.4.3 滴定管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度

实验室的温度在20℃±5℃范围内发生变化，符合一般实验的要求。依据平时的监测数据，黄酒中氨基酸态氮的测定环境温度为20℃±3℃，滴定基准物质邻苯二甲酸氢钾所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积为35.07 mL，查得水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，在置信概率p=0.95（对应的包含因子kp=1.96）下，体积的变化区间为：

V×水的膨胀系数×△T= ±（35.07×2.1×10-4×3）= ±0.022 mL。

则滴定管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度为：

3.2.4.4 人员读数所带来的不确定度

实际使用体积容器允许有1%的读数误差，假设为三角形分布，则由读数所引起的不确定度分量为：

综上3.2.4.1、3.2.4.4，各分量的合成不确定度为：

3.2.5 基准物质邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量引入的不确定度

基准物质邻苯二甲酸氢钾KHP的化学式为KC8H5O4，则KHP的摩尔质量为：

MKHP=1×39.0983+8×12.0107+5×1.00794+4×15.994=204.2212，每一种元素的标准不确定度可以按照IUPAC所给出的数值，结果见表3，以矩形分布求得。

表3 IUPAC标准不确定度

由表3可以求得：

则基准物质邻苯二甲酸氢钾KHP的摩尔质量引入的相对不确定度为：

现将3.2.1—3.2.5中所述各个不确定度分量进行列表说明，见表4。将表4中氢氧化钠标准滴定溶液浓度引入的不确定度分量进行合成，则由氢氧化钠标准滴定溶液浓度引入的不确定度u2rel为：

3.3 滴定黄酒实际消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积引入的不确定度

此滴定过程的不确定度有4个来源：（1）滴定管体积校准带来的不确定度；（2）充满液体至滴定管刻度变动性（滴定体积的重复性）引入的不确定度；（3）滴定管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度；（4）人员读数所带来的不确定度。

表4 不确定度分量

3.3.1 滴定管体积校准带来的不确定度

制造商给出滴定管体积的置信区间为±0.03 mL，则假设按照矩形分布，滴定管体积校准引起的不确定度为：

3.3.2 充满液体至滴定管刻度变动性（滴定体积的重复性）引入的不确定度

根据CNAS-GL06：2006《化学分析中不确定度的评估指南》中给出的经验典型值，滴定管的变动性标准偏差为0.0092 mL，则充满液体至滴定管刻度变动性（滴定体积的重复性）引入的不确定度为：

u2(VT2)=0.0092 mL。

3.3.3 滴定管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度

实验室的温度在20℃±5℃范围内发生变化，符合一般实验的要求。依据平时的监测数据，黄酒中氨基酸态氮的测定环境温度为20℃±3℃，滴定黄酒试样所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积为5.54 mL（扣除空白后体积），查得水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，在置信概率p=0.95（对应的包含因子kp=1.96）下,体积的变化区间为：

△V×水的膨胀系数×△T= ±（5.54×2.1×10-4×3）= ±0.0035 mL。

则滴定管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度为：

3.3.4 人员读数所带来的不确定度

实际使用体积容器允许有1%的读数误差，若假设为三角形分布，则由读数所引起的不确定度分量为：

综上3.3.1—3.3.4，各分量的合成不确定度为：

3.4 吸取黄酒试样时试样体积引入的不确定度

根据1.2分析测试的要求，需要用10.0 mL单刻线吸量管准确吸取黄酒试样10.0 mL，吸量管的不确定度来源为：校准、重复性、温度、人员读数。

3.4.1 校准带来的不确定度

所用到的吸量管为单标线吸量管，准确度等级为A级，最大允许误差为±0.020 mL，符合均匀分布（矩形分布），则校准带来的不确定度为：

3.4.2 重复性（充满液体至吸量管刻度变动性）引入的不确定度

依据CNAS-GL06：2006《化学分析中不确定度的评估指南》中给出的经验典型值，通过重复称量测定10次，计算出吸量管的变动性标准偏差为0.0092 mL，则重复性（充满液体至吸量管刻度变动性）引入的不确定度为：

u2(V10)=0.0092 mL。

3.4.3 吸量管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度

实验室的温度在20℃±5℃范围内发生变化，符合一般实验的要求。依据平时的监测数据，黄酒中氨基酸态氮的测定环境温度为20℃±3℃，吸取黄酒试样的体积10.00 mL，查得水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，在置信概率p=0.95（对应的包含因子kp=1.96）下,体积的变化区间为：

V×水的膨胀系数×△T= ±（10×2.1×10-4×3）

= ±0.0063 mL。

则吸量管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度为：

3.4.4 人员读数所带来的不确定度

实际使用体积容器允许有1%的读数误差，若假设为三角形分布，则由读数所引起的不确定度分量为：

综上3.4.1—3.4.4，各分量的合成不确定度为：

3.5 酸度计示值指示误差带来的不确定度

酸度计示值指示误差带来的不确定度主要来源于酸度计检定、温度变化。

3.5.1 检定引入的不确定度

根据计量检定证书，PP-15型酸度计的示值误差为0.01。由经验可知，在pH8.20附近的示值变化为0.01，此时用浓度为c=0.1062 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定黄酒，滴定至终点附近时，滴定液的加入量控制为半滴，在到达终点那一时刻，滴定液的加入量控制为三分之一滴，即为0.020 mL，按均匀分布（矩形分布），检定引入的不确定度为：

3.5.2 溶液温度与校正温度不同引起的不确定度

实验室的温度在20℃±5℃范围内发生变化，符合一般实验的要求。依据平时的监测数据，黄酒中氨基酸态氮的测定环境温度为20℃±3℃，近终点时滴定黄酒试样加入氢氧化钠标准滴定溶液的体积为0.020 mL，查得水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，在置信概率p=0.95（对应的包含因子kp=1.96）下,体积的变化区间为：

V×水的膨胀系数×△T= ±（0.020×2.1×10-4×3）= ±0.000013 mL。

则吸量管和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度为：

综上3.5.1—3.5.2，各分量的合成不确定度为：

4 合成不确定度的计算

将测量结果的各个不确定度分量以及大小列于表5中。

表5 合成标准不确定度分量表

现将各个不确定度分量进行合成，得到标准不确定度为：

在95%置信概率下，取包含因子k=2，得到测量结果的扩展不确定度：

U=k×u=2×0.013=0.026≈0.03 g/L。

5 测量结果不确定度的报告及表述

黄酒试样中氨基酸态氮含量为：(0.82±0.03)g/L(k=2)。

6 讨论

评定合成标准不确定度时,应避免遗漏重要的不确定度分量,同时也要避免重复地计算,特别需要引起注意的是应合理地评定主要的不确定度分量。可以通过适当的试验,比如比对试验、重复性试验等，来证实所计算不确定度的合理性。当验证结果出现偏离时,应查明偏离的原因,必要时可以重新进行评定。影响结果不确定度的分量很多,其数值大小不一样,对最后结果的不确定度贡献也不一样。在实际工作中,可以忽略引入数值较小的不确定度分量,这样既可以简化评定程序,而且也不会影响最后的评定结果。

利用氢氧化钠标准滴定溶液滴定黄酒中的氨基酸态氮，影响测定结果的主要因素是试样的重复性测定、氢氧化钠标准滴定溶液的浓度、滴定黄酒实际消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积、吸取黄酒试样时试样体积、酸度计示值指示误差。无论是采用A类方法评定，还是采用B类方法评定，对氨基酸态氮测定结果的合成不确定度都有一定的贡献，在不确定度评定中都是不可忽略的。通过对黄酒中氨基酸态氮含量测量结果的各种不确定度分量的来源逐一进行分析和量化,评定出了测量结果的合成标准不确定度和扩展不确定度,为同类方法测量结果的不确定度评定提供一种参考。

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