超声波辅助水提取淡竹叶黄酮和固形物的工艺研究

葛 青，毛建卫，吴良如，范 煜，方吉雷，孙雨欣

(1.浙江科技学院 生化学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州 310023；2.国家林业局竹子研究开发中心，浙江 杭州 310012； 3.浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江 杭州 310012)

竹叶中富含黄酮、多糖[1]、叶绿素、特种氨基酸等多种生物活性物质。黄酮类化合物具有明显的抗溃疡、解痉、抗炎及降血脂等多种生物活性[2]。在食品、药品、化妆品等产品中，许多黄酮类提取物已得到一定的利用[3]。目前，竹叶黄酮的提取方法主要以乙醇[4，5]、丙酮[6]等作为溶剂进行热回流提取，该方法应用于工业化生产时，存在耗能较大、耗时较长，且步骤较繁琐，增加二次污染的机会，增加企业生产成本，同时水溶性也比较差，降低了原本的活性等缺点。因此，在实际生产中，很多食品企业往往采用水作为萃取溶剂的水浸提法，其具有提取成本较低，但提取效率低。因此，寻找一条效率高、成本低、污染小的竹叶有效成分提取新工艺成为人们所关心的问题。本实验采用正交试验分析法，对超声波辅助水提取竹叶总黄酮和固形物含量的工艺条件进行了优化，为更好地开发利用我国丰富的竹叶资源提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淡竹叶(采自浙江科技学院后山)；乙醇，硝酸铝，氢氧化钠，亚硝酸钠，芦丁(标准品)，95%乙醇，无水乙醇，浓硫酸，无水乙醚，丙酮，苯酚，葡萄糖等，均为分析纯。

1.2 主要仪器

循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；5500PC紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；TP214电子天平(赛多利斯丹佛)；RE52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司)；KQ-500E超声波清洗器(上海科学仪器有限公司)；TD5KR冷冻高速离心机(长沙东旺试验仪器公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海叶拓实业有限公司)；循环水式真空泵(杭州大卫科技有限公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1竹叶黄酮的提取 将采回的竹叶洗净，在60 ℃的恒温干燥箱中烘干，然后粉碎，过60目筛，放入干燥器中备用。取适量的竹叶放入超声波提取装置中，按所设定的提取温度、提取时间、超声功率、料液比以及提取次数，加入适量的纯净水进行超声提取。浸提结束后减压抽滤，收集滤液，浓缩，测定黄酮含量和固形物含量。

1.3.2竹叶黄酮含量的测定 采用硝酸铝比色法测定黄酮含量[7-8]。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of Rutin

1.4 试验设计

1.4.1单因数实验 以水作为溶剂提取总黄酮和固形物含量，研究不同提取时间(10 min、20 min、30 mim、40 min、50 min、60 min)提取温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40)频率(30 kHz、40 kHz、50 kHz、70 kHz、70 kHz)提取次数(1、2、3、4)对其得率影响。采用硝酸铝比色法测定黄酮含量，计算得率。

1.4.2正交实验 在单因数实验的基础上，采用L9(34)正交表，以黄酮得率和固形物得率为参考指标，对超声时间，料液比，频率，提取次数4个主要因数做正交试验。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的制作

试验以芦丁标准品作为对照，采用硝酸铝比色法测定黄酮含量。以吸光度D(λ)为纵坐标，标准液浓度(mg·L-1)为横坐标，绘制标准曲线，得到拟合方程y=0.0122x-0.0809，R2=0.9991。

2.2 单因数实验

2.2.1超声时间对固形物和总黄酮得率的影响 在料液比1∶20，提取温度60 ℃，超声频率40 kHz的条件下，分别在超声时间为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min的条件下提取1次，研究超声时间对竹叶中固形物和总黄酮得率的影响。实验结果见图2。从图2可知：在10～30 min内，随着时间的增加，总黄酮和固形物的得率与提取时间呈正相关，但提取时间到30 min后，总黄酮得率增加缓慢，固形物得率到提取时间达到40 min后增加缓慢。因此，确定最佳提取时间为40 min。

2.2.2提取温度对总黄酮和固形物得率的影响 在料液比1∶20，提取时间40 min，超声频率40 kHz的条件下，分别在提取温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的条件下各提取1次，研究提取温度对竹叶中固形物和总黄酮得率的影响。实验结果见图3。从图3可知：随着温度的升高，提取液中总黄酮含量和固形物的含量不断增加，但到70 ℃后，固形物得率不在增加，总黄酮得率增加缓慢，考虑到提取温度越高，能耗越大，所以选选择70 ℃为最佳提取温度。

图2 提取时间对固形物和总黄酮得率的影响Fig.2 The effect of extraction time on the yield of solid content and total flavones

图3 提取温度对固形物和总黄酮得率的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on the yield of solid content and total flavones

图4 料液比对固形物和总黄酮得率的影响Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the yield of solid content and total flavones

2.2.3料液比对总黄酮和固形物得率的影响 在提取温度70 ℃，超声频率40 kHz，超声时间40 min的条件下，分别在料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40的条件下各提取1次，研究料液比对竹叶提取中固形物和总黄酮得率的影响，实验结果见图4。从图4可知：固形物和总黄酮得率随着料液比的增加而增加，尤其在料液比1∶10～1∶30时，固形物和总黄酮得率增加比较快，增加到1∶40时，增加趋势有所减缓，考虑到其上升趋势比较缓慢，后期浓缩等处理成本高，所以选1∶30为最佳料液比。

2.2.4超声频率对总黄酮和固形物得率的影响 在提取温度70 ℃，料液比1∶20，超声时间40 min的条件下，分别在超声频率为30 kHz、40 kHz、50 kHz、60 kHz、70 kHz的条件下各提取1次，研究超声频率对竹叶提取中固形物和总黄酮得率的影响，实验结果见图5。从图5可知：随着超声频率的增加，竹叶提取物中固形物含量和总黄酮得率不断增加。超声频率超过50 kHz后，固形物和总黄酮得率增加减缓，所以选择超声频率为50 kHz。

2.2.5提取次数对总黄酮和固形物得率的影响 在提取温度70 ℃，料液比1∶20，超声时间40 min，超声频率40 kHz的条件下，对比浸提次数对竹叶提取中固形物和总黄酮得率的影响，实验结果见图6。从图6可知：随着提取次数的增加，竹叶提取物中固形物含量和总黄酮得率不断增加。到提取2次后固形物得率继续增加，而黄酮得率基本不变。考虑到时间和能耗成本，选2次为最佳提取次数。

图5 超声频率对固形物和总黄酮得率的影响Fig.5 The effect of ultrasonic frequency on the yield of solid content and total flavones

图6 提取次数对固形物和总黄酮得率的影响Fig.6 The effect of extraction times on the yield of solid content and total flavones

2.3 正交试验

通过单因素试验初步确定超声辅助水提取竹叶中总黄酮和固形物的工艺条件为提取温度70 ℃，提取时间40 min，料液比1∶30，提取次数2次，超声频率50 kHz。在单因数实验的基础上，采用L9(34)正交表，以总黄酮得率和固形物得率为参考指标，对超声时间，料液比，频率，提取次数等4个主要因数做正交试验，每个试验进行3次。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因数水平表L9(34)

超声波辅助水提取竹叶总黄酮得率正交实验结果及极差分析见表2，数据处理采用直观分析方法，以极差大小确定因素主次顺序。从表2中极差分析可知：影响总黄酮得率的主要因素是超声频率，其次是料液比和超声温度，超声时间对总黄酮得率的影响最小。总黄酮提取的最佳组合为A2B1C1D3，即提取时间40 min，料液比1∶20，超声温度70 ℃，超声频率40 kHz。

超声波辅助水提取竹叶固形物得率正交实验结果及极差分析见表3，数据处理采用直观分析方法，以极差大小确定因素主次顺序。从表3中极差分析可知，影响固形物得率的主要因素是超声温度，其次是超声时间和超声频率，料液比对总黄酮得率的影响最小。固形物提取的最佳组合为A3B2C3D3，即提取时间50 min，料液比1∶40，超声温度70 ℃，超声频率50 kHz。

2.4 验证试验

在最佳条件下进行验证试验，平行实验 3 次，测得总黄酮得率为1.23%，固形物得率为 13.15%，该结果大于单因素实验最佳条件的得率。说明各因素间相互作用可以提高竹叶总黄酮和固形物得率，达到更好的提取效果。

表2 总黄酮正交试验结果

表3 固形物正交试验结果

4 结论

本实验所采用超声波辅助水提取淡竹叶总黄酮的最佳工艺条件为提取时间40 min，料液比1∶20，超声温度70 ℃，超声频率40 kHz。在此最佳工艺条件下总黄酮得率为1.23%。超声波辅助提取固形物的最佳工艺条件：提取时间50 min，料液比1∶40，超声温度70 ℃，超声频率50 kHz。在此最佳工艺条件下固形物得率为 13.15%。本法(超声波辅助水提取法)与传统有机溶剂提取黄酮得率1.0%～1.3%相差不大，符合实验预期，同时水是安全溶剂，具有提取条件温和、操作简便省时等优点，适合大规模地推广，更有利于保持黄酮的生物活性，从而为竹叶黄酮保健功效的研究和相关产品的研发奠定基础。

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