微波辅助提取牡丹籽粕多糖工艺优化及其体外抗氧化活性

, ,,,国安

(河南科技大学,洛阳市牡丹生物学重点实验室,牡丹种质创新与精深加工河南省工程实验室,河南洛阳 471023)

牡丹是原产中国的特色花卉,传统上主要用于观赏和入药,被人们认为是富贵吉祥、繁荣昌盛的象征,在全国各地广泛种植,其中以河南洛阳、山东菏泽种植最多。近年来,牡丹籽油开发呈现良好态势,油用牡丹做为新型木本油料作物在全国的种植面积迅速扩大,对满足我国对优质食用油需求和防范食用油安全风险具有重要意义[1-2]。牡丹籽油生产产生的大量牡丹籽粕副产物,包含有丰富的活性成分和营养物质,如多糖、糖蛋白、蛋白质和矿质元素等[3]。

植物多糖来源广泛,从植物的根、茎、叶、花、果实、种子及其他器官[4],均有成功提取活性多糖的报道。尤其是提取植物油脂后的大量饼粕副产物,成为植物多糖最为重要的来源,如油茶、大豆、花生等饼粕[5-6]。生物多糖具有清除自由基的作用,补充多糖具有明显的抗氧化功能[7-9]。植物多糖是极性大分子化合物,其提取工艺多以热水法为基础。在多糖提取的研究中采用溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声波法、微波法等多种方法。随着微波技术和设备的日趋完善,微波辅助法提取植物多糖的工艺优化为生产应用奠定了良好基础[10-12]。张利霞等[13]通过响应面法优化测得牡丹皮多糖提取率为3.727%,王洪政等[14]、路祺等[15]分别测得牡丹果荚多糖提取率为8.77%和8.34%,湛志伟等[16]通过正交实验测得牡丹种仁的提取率为3.825%,表明牡丹果荚、种皮和种仁中均含有多糖成分。王洪政等[14]用DPPH法证明牡丹荚果多糖有明显的抗氧化活性。因此,对牡丹籽粕多糖在医药保健品和天然抗氧化剂等领域的深入研究,具有重要的理论和应用价值。

目前,对牡丹籽油提取工艺研究较多[17-18],而对籽粕综合利用研究的报道较少。本研究采用微波法辅助提取牡丹籽粕中粗多糖,通过正交实验对提取多糖的工艺参数(微波处理时间、功率、籽粕粒度和料液比)进行了优化,并分析了牡丹籽粕多糖的体外抗氧化活性,以期为牡丹籽粕的综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

‘凤丹’牡丹籽 经超临界萃取牡丹籽油后的籽粕,密封保存于4 ℃冰箱备用;三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、丙酮、乙醚、盐酸、氢氧化钠、酚酞、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、碘、碘化钾、硫酸亚铁、三氯乙酸、抗坏血酸(VC)、二丁基羟基甲苯(BHT)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫代巴比妥酸(TBA) 均为国产分析纯试剂。

格兰仕WD800G-BL20微波炉 顺德市格兰仕电器实业有限公司;RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;JA8102电子天平 上海精密电子仪器有限公司;TU1810 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;HH-S2数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;索氏抽提器 上海瀚赫国际贸易有限公司;LD4-2低速离心机 北京医用离心机厂;XH-B涡旋混合器 无锡沃信仪器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 多糖的提取

1.2.1.1 多糖微波法提取工艺流程 称取粉碎、过筛分级的牡丹籽粕适量,乙醚回流脱脂3 h(固液比1∶3,W/V),40 ℃烘干。准确称取合适粒度的牡丹籽粕2.00 g放入三角瓶,加入适量的蒸馏水,经一定的微波功率下间歇处理一段时间,50 ℃保温振荡30 min,然后4000 r/min离心25 min,取上清液,再加入25%体积的Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇=4∶1),剧烈振荡20 min,4000 r/min离心20 min,取上清液重复脱蛋白,直至离心后无蛋白中间层出现。然后将上清液减压浓缩至适量,再加入3倍体积的无水乙醇,静置过夜。4000 r/min离心25 min,沉淀部分经无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤,静置沉淀离心,弃上清后40 ℃干燥箱中干燥,即可获得牡丹籽粕粗多糖(PS)。

1.2.1.2 多糖含量测定 以葡萄糖为对照品,采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定牡丹籽粕还原糖含量。将提取的牡丹籽粕粗多糖用蒸馏水溶解,定容至250 mL。准确吸取稀释液10 mL,加入6 mol/L HCl溶液5 mL,沸水浴中水解0.5 h,冷却后用6 mol/L NaOH溶液中和至pH呈中性,然后用蒸馏水定容至100 mL。分别取1 mL糖提取液和糖水解液,测定还原糖含量。按下列公式计算样品多糖提取得率:

还原糖(%)=C1V1/m×100

总糖(%)=C2V2N/m×0.9×100

多糖提取得率(%)=总糖-还原糖

式中:C1为还原糖的质量分数(mg/mL),V1为样品总糖溶液的体积(mL),C2为水解后还原糖的质量分数(mg/mL),V2为样品总糖水解液的体积(mL),N为稀释倍数,m为样品的质量(mg)。

1.2.2 牡丹籽粕多糖提取单因素实验 根据预实验的结果,影响牡丹籽粕多糖微波辅助提取的主要因素有微波处理时间、微波功率、籽粕粒度、料液比等。

1.2.2.1 微波处理时间 分别为1、2、3、4、5、6、7、8和9 min,在微波功率160 W、物料粒度60目、料液比1∶15 g/mL条件下提取一次,考察微波处理时间对多糖得率的影响。

1.2.2.2 微波功率 分别为160、320、480、640和800W,在微波处理时间7 min、物料粒度60目、料液比1∶15 g/mL条件下提取一次,考察微波功率对多糖得率的影响。

1.2.2.3 物料粒度 分别为20、40、60、80、100和120目,在微波处理时间7 min、微波功率480 W、料液比1∶15 g/mL条件下提取一次,考察物料粒度对多糖得率的影响。

1.2.2.4 料液比 分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35,在微波处理时间7 min、微波功率480 W、物料粒度80目条件下提取一次,考察料液比对多糖得率的影响。

1.2.3 牡丹籽粕多糖提取正交实验 根据单因素实验确定的条件范围,进行微波处理时间、功率、籽粕粒度和固液比4因素3水平的正交实验,选用L9(34)正交实验,确定提取多糖的最佳工艺参数,水平因素见表1。结果由极差分析和SPSS 20.0软件进行方差分析,确定各因素对多糖提取得率的影响大小和多糖最优提取工艺。

表1 微波法提取牡丹籽粕多糖正交实验因素水平表Table 1 The orthogonal test factors and levels of tree peony seed meal by Microwave extract

1.3体外抗氧化活性

1.3.1 DPPH自由基体系 按彭长连等[19]和Larrauri等[20]的方法加以改进。将1 mL不同浓度的多糖水溶液加入2 mL 100 μmol/L DPPH乙醇溶液中,以等体积的双蒸水代替多糖溶液作为对照,用乙醇溶液为空白对照调零。室温放置30 min后,用分光光度计测定517 nm处的吸光值,实验重复3次。清除DPPH自由基活性用抑制率(%)表示。

抑制率(%)=(对照管A517-样品管A517)/对照管A517×100。

以脂溶性BHT(200 μg/mL)与水溶性VC(80 μg/mL)的乙醇溶液做阳性对照,绘制清除DPPH自由基的时间效应曲线,对比60 μg/mL牡丹籽粕多糖(PS)溶液的作用时间效应曲线,以此推断牡丹籽粕多糖的抗氧化剂的作用特性。

1.3.2 卵黄脂蛋白PUFA过氧化体系中抗氧化活性的测定 按张尔贤等[21]和史国安等[22]方法,建立以Fe2+诱发卵黄磷脂C-2上的极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白PUFA的过氧化模型。

取新鲜的鸡蛋黄加等体积的无菌蒸馏水,制备蛋黄悬浮液。 配制100 μg/mL PS水溶液和30%乙醇溶液,及80 μg/mL VC和 200 μg/mL BHT的乙醇溶液做阳性对照。反应体系:0.2 mL蛋黄悬浮液,0.2 mL 25 mmol/L FeSO4,1.5 mL磷酸盐缓冲液(pH7.0),0.1 mL 样品溶液,将试管置于 37 ℃水浴中温浴 60 min,然后加入 2.0 mL质量分数为 0.5% TBA-20% TCA 溶液,沸水浴15 min,迅速冷却,于 3500 r/min离心5 min,以空白管调零(以等量的蒸馏水代替),测定 532 nm处的吸光值。对照管以等量的提取介质代替,其他同样品管。样品抗氧化活性(AOA)用卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率(%)表示。

AOA(%)=(对照管A532-样品管A532)/对照管A532×100。

1.4数据统计分析

实验数据用SPSS 20.0进行统计分析。采用邓肯氏新复极差法检验,以p<0.05为差异显著性。

2 结果与分析

2.1牡丹籽粕多糖的单因素提取实验

2.1.1 微波处理时间对牡丹籽粕多糖得率的影响 由图1可知,相同条件下,牡丹籽粕多糖得率随微波处理时间延长而升高,当微波处理时间超过7 min时,牡丹籽粕多糖得率反而略有下降。可能由于在极性溶剂水中,植物细胞结构受到微波辐射的破坏,使细胞内渗透压升高更容易破壁,而微波处理时间长导致较多杂质溶出和多糖水解的缘故。由于微波处理时间7 min 时优势显著,因此选择微波处理时间7 min为最佳处理时间。

图1 微波处理时间对多糖得率的影响Fig.1 Effect of microwave time on polysaccharide yield

2.1.2 微波功率对牡丹籽粕多糖得率的影响 由图2可知,牡丹籽粕多糖随微波功率的提高呈现升高趋势,当微波功率480 W时,多糖得率最高,之后反而下降。可能由于功率过大加速了提取液的流动和物料的温度,在提高多糖浸出的同时加速了多糖的水解。故选择微波功率320～640 W范围内进一步优化实验。

图2 微波功率对多糖得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharide yield

2.1.3 物料粒度对牡丹籽粕多糖得率的影响 由图3可知,随着物料粒度的增大粒径减小,牡丹多糖得率迅速升高。当粒度20～80目范围内,多糖得率增加明显,而物料粒度超过80目,则多糖得率反而下降。可能粒径过大则细胞壁破坏困难,多糖溶出扩散运动阻力也随之增加;粒度过小多糖容易溶出,但也亦导致提取液粘度增大的缘故。故选择物料粒度60～100 目范围内进一步优化实验。

图3 物料粒度对多糖得率的影响Fig.3 Effect of material size on polysaccharide yield

2.1.4 料液比对牡丹籽粕多糖得率的影响 由图4可知,当料液比由1∶15 g/mL增加到1∶30 g/mL时,牡丹籽粕多糖得率不断升高,当料液比大于1∶30 g/mL时,多糖得率趋于稳定不再升高。在一定范围内,提取液用量越大,多糖得率越高;但当提取液用量过多时,多糖的浸出趋于完全,可能由于此时细胞壁破坏彻底,多糖溶出较完全的原因。故此选择料液比为(1∶20～1∶30) g/mL进一步优化实验。

图4 料液比对多糖得率的影响Fig.4 Effect of material to liquid ratio on polysaccharide yield

2.2牡丹籽粕多糖的提取工艺优化

根据表2可知,微波法辅助提取工艺中,各因素对牡丹籽粕多糖提取得率的影响力大小依次为为:料液比>微波功率>籽粕粒度>微波处理时间。最佳提取工艺条件为A3B2C3D2:微波提取时间8 min,微波功率480 W,粒度100目,料液比1∶25。

由表3可见,微波处理功率、固液比、籽粕粒度对提取结果的影响差异极显著,微波处理时间对提取结果影响差异显著。

表2 正交实验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal test

由于正交实验所得的最佳工艺条件A3B2C3D2不在正交实验表中,故做验证实验,与正交表中多糖得率最高的工艺条件A1B2C2D2进行对比实验。按照最佳提取工艺验证实验,牡丹籽粕多糖最高提取得率为9.21%,实验结果表明最佳工艺条件仍为A3B2C3D2。

表3 微波法提取结果的方差分析Table 3 Analysis of variance of microwave extraction results

注:*p<0.05,差异显著;**p<0.01,差异极显著。

2.3体外抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基活性 从图5时间效应曲线可以看出,清除DPPH反应体系中,水溶性抗氧化剂VC(80 μg/mL)能够在短时间内达到反应平衡,而脂溶性抗氧化剂BHT(200 μg/mL)达到反应平衡的时间超过50 min。牡丹籽粕多糖(60 μg/mL PS)清除DPPH自由基的时间效应曲线与VC类似,由此推测PS抗氧化作用的类型类似于水溶性抗氧化剂VC。

图5 不同效应物清除DPPH自由基的浓度和时间效应曲线Fig.5 Time curves of scavenging effects of different effectors on DPPH

由图6可知,牡丹籽粕多糖清除DPPH自由基的能力呈现出明显的量效关系。随着反应体系中牡丹籽粕多糖溶液质量分数的提高,清除DPPH自由基的能力逐渐增强,当质量分数为100 μg/mL时,清除率达80%以上。PS的IC50为43.22 μg/mL,大于VC的IC50(4.52 μg/mL)和BHT的IC50(21.20 μg/mL)。说明PS对DPPH自由基的亦有较强的清除能力,揭示PS具有较强的抗氧化活性。

图6 牡丹籽粕多糖对DPPH自由基的清除效应Fig.6 Scavenging effects of crude polysaccharide on DPPH

2.3.2 卵黄脂蛋白PUFA过氧化体系中抗氧化活性 图7示出,100 μg/mL PS水溶液的抗氧化活性略高于体积分数30%乙醇多糖溶液,两种溶液(100 μg/mL)的AOA值为20%～30%,但低于阳性对照VC(80 μg/mL)和BHT(200 μg/mL)。提示PS具有一定的抑制脂质过氧化产物形成的能力,生物抗氧化效应明显。

图7 牡丹籽粕多糖(PS)抗脂质过氧化活性Fig.7 Antilipoperoxidation activity of polysaccharides from tree peony seed meal

3 结论

本研究以‘凤丹’牡丹籽粕为原料,采用微波辅助法提取牡丹籽粕中多糖,在单因素实验的基础上,通过正交实验设计,优化了最佳的提取工艺条件。正交实验表明,各因素对多糖得率的影响大小依次为固液比>微波功率>籽粕粒度>微波处理时间,最佳微波提取工艺条件为:提取时间8 min,微波功率480 W,粒度120目,固液比1∶25 g/mL。在最佳工艺条件下,一次牡丹籽粕多糖提取率达到9.21%。微波辅助法是提取牡丹籽粕中水溶性多糖的一种简单高效的好方法。

牡丹籽粕含有丰富的生物多糖。体外抗氧化实验发现,牡丹籽粕多糖(PS)对DPPH的清除能力呈现良好的量效关系,抑制卵黄脂蛋白PUFA过氧化能力明显,具有较强的抗氧化能力。表明牡丹籽粕多糖有可成为一种新的天然抗氧化剂。本研究结果为进一步探讨牡丹籽粕多糖做为食品添加剂、天然抗氧化剂等中的综合利用提供了科学依据。

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